摘要: 目的：1.建立鉴定分枝杆菌不同种及种内不同株的16S rRNA基因和16S-23SrRNA ITS序列分析方法，进一步了解16S rRNA基因和16S-23S rRNA ITS在菌种和菌株鉴定中的应用价值，了解其能鉴定的分枝杆菌种类和数量。2.掌握123种共213株分枝杆菌参考菌株的16S... 展开 目的：1.建立鉴定分枝杆菌不同种及种内不同株的16S rRNA基因和16S-23SrRNA ITS序列分析方法，进一步了解16S rRNA基因和16S-23S rRNA ITS在菌种和菌株鉴定中的应用价值，了解其能鉴定的分枝杆菌种类和数量。2.掌握123种共213株分枝杆菌参考菌株的16S rRNA基因5′端和16S-23S rRNA ITS序列，补充基因数据库的不足。 方法：1.根据分枝杆菌16S rRNA基因和16S-23S rRNA ITS序列属特异性保守区设计引物，对123种(共213株)分枝杆菌的16S rRNA基因5′端和16S-23S rRNA ITS序列分别进行PCR扩增、序列测定，用Clustalx 1.83软件对不同种及种内不同株分枝杆菌的16S rRNA基因5′和16S-23S rRNA ITS分别进行同源性多序列比对，并用邻位相连法(Neighbour Joining，N-J法)绘制聚类分析树状谱，使用DNA STAR的MegAlign软件计算种间及种内不同株之间的相似性百分比。 结果： 1.完成119种共包括209株分枝杆菌的16S rRNA基因测序工作，完成123种共包括213株分枝杆菌的16S-23S rRNA ITS测序工作。 2.在做种间分析时发现3株鸟分枝杆菌复合群成员的16S rRNA基因序列、16S-23SrRNAITS分别完全相同；5株结核分枝杆菌复合群成员的16S rRNA基因、16S-23S rRNAITS分别完全相同；海分枝杆菌与溃疡分枝杆菌16S rRNA基因、16S-23S rRNA分别完全相同；两种靶基因均不能将以上分枝杆菌相互鉴别。 16S rRNA基因不能鉴别的还有结核分枝杆菌95052(ATCC35810)与其他5株结核分枝杆菌复合群成员；胃分枝杆菌与堪萨斯分枝杆菌；产鼻疽分枝杆菌与塞内加尔分枝杆菌：龟分枝杆菌与脓肿分枝杆菌；猪分枝杆菌与M.boenickei；母牛分枝杆菌(95050)与南非分枝杆菌；M.peregrinum与M.septicum：M.vanbaalenii与母牛分枝杆菌(95051)；M.frederiksbergense与浅黄分枝杆菌：M.murale与东海分枝杆菌；但16S-23S rRNA ITS可以将以上分枝杆菌相互鉴别。 16S-23S rRNAITS不能鉴别的还有副结核分枝杆菌与鸟分枝杆菌复合群；千田分枝杆菌、田野分枝杆菌与5个结核分枝杆菌复合群成员；金色分枝杆菌与东海分枝杆菌；抗热分枝杆菌与副偶然分枝杆菌；M.vanbaalenii与南非分枝杆菌；微黄分枝杆菌与灰尘分枝杆菌；奥布分枝杆菌与母牛分枝杆菌；杜氏分枝杆菌与猪分枝杆菌；M.hassiacum与M.pyrenivorans：但16S rRNA基因可以将以上分枝杆菌相互鉴别。 3.在对其中7种包括97株分枝杆菌进行种内不同株序列分析时发现16S rRNA基因可将13株草分枝杆菌分为3个基因型，18株偶发分枝杆菌分为6个基因型，17株耻垢分枝杆菌分为4个基因型，8株戈登分枝杆菌分为3个基因型，9株龟分枝杆菌龟亚种分为3个基因型，15株堪萨斯分枝杆菌分为2个基因型，17株产鼻疽分枝杆菌分为1个基因型；而16S-23S rRNA可依次将上述分枝杆菌分为3个，15个，7个，3个，4个，3个，5个基因型。 结论 1.16S rRNA基因和16S-23S rRNA ITS序列分析是分枝杆菌菌种鉴定的良好方法，两种方法结合可在很短时间内将除鸟分枝杆菌复合群、结核分枝杆菌复合群、海分枝杆菌与溃疡分枝杆菌之外的大部分(123种中的113种)分枝杆菌鉴定到种。2.16S-23S rRNA ITS的种内多态性较16S rRNA基因强，不仅能鉴别16S rRNA.基因能鉴别的菌株，还能鉴别16S rRNA基因无法鉴别的菌株。与16S rRNA基因相比16S-23SrRNA ITS更适合种内不同株的分型和鉴定。3.所有菌株的基因序列均可做为临床上分枝杆菌鉴定的标准参考序列，补充了基因数据库的不足，为下一步分枝杆菌菌种鉴定探针的设计、基因芯片的研究打下良好基础，并为分枝杆菌背景资料研究提供重要的基础资料。 收起