摘要: 目的：优化设计CA-MA杂合肽基因，寻找合适的突变位点，利用PCR技术对CA-MA基因进行定点突变，并将天然型(CA-MA)与突变型(W16-CA-MA)分别在大肠杆菌中融合表达，进行初步的纯化，为进一步研究CA-MA结构与功能的关系奠定基础。 方法:根据Genebank中... 展开 目的：优化设计CA-MA杂合肽基因，寻找合适的突变位点，利用PCR技术对CA-MA基因进行定点突变，并将天然型(CA-MA)与突变型(W16-CA-MA)分别在大肠杆菌中融合表达，进行初步的纯化，为进一步研究CA-MA结构与功能的关系奠定基础。 方法:根据Genebank中CA-MA DNA序列及氨基酸残基序列，按照Codon Usage Database中大肠杆菌偏爱密码子原则对CA-MA基因进行优化设计。利用基因重组技术构建克隆重组体pUC-18-CA-MA，转化至大肠杆菌DH5a中，经a 互补筛选，挑出阳性菌落，抽提重组质粒鉴定后测序；构建表达重组体pGEX-4T-1-CA-MA，转化大肠杆菌BL21，经筛选后挑取菌落，抽提重组质粒鉴定后测序。根据CA-MA结构，寻找合适的突变位点，设计突变引物，利用反转PCR定点突变技术，采用TaKaRa MutantBEST Kit对重组体pGEX-4T-1-CA-MA中CA-MA的第16位密码子由AGT变为TGG。将突变体转化至大肠杆菌BL21中，挑出阳性菌落，抽提重组质粒鉴定后测序。将两种阳性的重组转化菌落用IPTG 37℃诱导表达， SDS-PAGE电泳观察表达结果。抽提全菌体蛋白，用GSTrapFF亲和层析柱纯化得到GST-CA-MA和突变体GST-W16-CA-MA融合蛋白。 结果： 1、获得优化的CA-MA DNA片段，大小为66bp；构建了克隆重组体pUC-18-CA-MA，经酶切和DNA测序鉴定，结果表明与预先设计的DNA序列完全一致。 2、CA-MA基因与表达载体连接，转化至大肠杆菌BL21，抽提重组质粒，经酶切和DNA测序鉴定，结果表明表达重组体pGEX-4T-1-CA-MA构建成功，CA-MA基因与表达载体连接方向正确，可以进行诱导表达。 3、成功实现了对CA-MA基因的定点突变，获得突变型表达重组体pGEX-4T-1-W16-CA-MA，转化至大肠杆菌BL21中，测序结果表明CA-MADNA序列中第16位密码子由AGT变为TGG，达到预期突变结果。W16-CA-MA基因与表达载体连接方向正确，可以进行诱导表达。 4、两种表达菌经IPTG诱导表达3～5h后，SDS-PAGE电泳结果可见约29KD的融合蛋白条带，表达的融合蛋白经GSTrapFF亲和层析柱纯化后电泳，表明融合蛋白以包涵体形式存在。 结论：成功构建了表达重组体pGEX-4T-1-CA-MA及突变型表达重组体pGEX-4T-1-W16-CA-MA，并在大肠杆菌中诱导表达成功。初步得到GST-CA-MA和突变体GST-W16-CA-MA融合蛋白，为其进一步抗病毒活性的研究、筛选高活性的CA-MA衍生肽及真核表达奠定了基础。 收起