摘要: 第一部分 目的：探讨Hck基因在大鼠胚胎心脏发育过程中的时空表达规律、过表达Hck基因对P19向心肌细胞分化的影响及过表达Hck对工具细胞功能的影响，从而分析其与心脏发育的关系。 方法：1)取大鼠胚胎12、15、19d心脏，采用RT-PCR技术检测心脏组... 展开 第一部分 目的：探讨Hck基因在大鼠胚胎心脏发育过程中的时空表达规律、过表达Hck基因对P19向心肌细胞分化的影响及过表达Hck对工具细胞功能的影响，从而分析其与心脏发育的关系。 方法：1)取大鼠胚胎12、15、19d心脏，采用RT-PCR技术检测心脏组织中Hck基因mRNA的表达丰度，并应用原位杂交技术对Hck基因表达进行定位分析。2)构建Hck真核表达载体转染入P19细胞，筛选稳定表达株并进行DMSO诱导分化方案诱导其向心肌细胞分化，在诱导的第10天观察心肌细胞的跳动并抽提细胞总蛋白，用Western-b1ot方法检测cTnI的表达。3)构建p56Hck及其突变体的荧光表达载体，并瞬时转染HeLa细胞，进行F-actin染色及微管蛋白免疫组化，或应用Phagokinetic track motility assay及体外侵蚀实验检测HeLa细胞迁移及侵袭能力的变化。 结果：1)在胚胎12、15、19d心脏中，Hck基因均有表达，但主要表达于心脏间质，在心肌细胞中不表达，其表达随胚龄增加呈逐渐上调趋势(P<0.05)。2)在P19分化第10天，相差显微镜下观察Hck转染组跳动的心肌细胞集落的数目及面积未有变化，Hck转染组cTnI的表达量与对照组无显著区别(P>0.05)。3)过表达p56Hck/p56Hckca能促使HeLa细胞细胞膜突起增多、F-actin及细胞微管蛋白的重新分布，并促进HeLa细胞的迁移及侵袭能力增强。 结论：Hck基因表达于心脏间质而在心肌细胞中无表达，其表达丰度与大鼠胚胎心脏发育时间有关；Hck的过表达并不影响P19细胞向心肌细胞分化；Hck基因功能可能与心脏间质细胞的迁移黏附等功能相关，Hck功能缺陷可能通过影响心脏间质细胞的功能而导致先天性心脏病的发生。 第二部分 NFATcl基因与心脏发育缺陷关系的研究 目的：探讨NFATcl敲除导致小鼠心脏瓣膜及室间隔缺陷的具体原因及在心脏发育中受NFATcl调控的下游分子。 方法：1)取经genotyping验证的E9.5-E13.5 NFATcl敲除小鼠和野生型小鼠，固定、包埋、切片后应用免疫组化方法检测凋亡因子Caspase3，细胞增殖标志蛋白PCNA、K167，及FGFR1、RGS10的表达；2)分离并原代培养小鼠胚胎E11.5心内膜细胞(ECC)，应用CSA、FK506分别抑制或应用PMA+ionomycin激活ECC细胞中Cacinurin-NFATcl通路后来研究对FGFR1、RGSl0表达的影响；3)预测并克隆FGFR1的内含子区域NFATcl结合位点，构建成Luciferase报告基因系统载体，与NFATcl真核表达载体共转染MEF细胞，分别在培养基含或不含ionomycin的情况下测定荧光素酶活性。 结果：1)相对于野生型小鼠，NFATcl敲除小鼠心脏开始出现凋亡的时间并无提前，二者均于E12.5开始在心脏发育中的内膜垫区域出现凋亡，主要位于室间隔膜部及瓣膜位置并在E13.5凋亡达到高峰。然而NFATcl敲出小鼠的凋亡程度重于野生型；2)NFATcl敲除小鼠胚胎心脏增殖减弱表现在瓣膜形成期，主、肺瓣膜内膜细胞缺乏增殖能力；3)FGFR1在NFATcl敲除小鼠胚胎心脏发育过程中出现两次下调，第一次表达的下调发生于E10.5，主要集中于动脉干及心内膜垫区域；第二次表达的下调发生于E13.5，只位于心脏瓣膜。FGFRl的内含子区域存在着一个NFATcl的结合位点。应用CSA、FK506分别抑制ECC细胞中Cacinurin-NFATcl通路后FGFR1的表达下调；应用PMA+ionomycin激活ECC细胞中Cacinurin-NFATcl通路后FGFRl的表达上调。4)RGSl0在NFATcl-1-小鼠心内膜细胞的表达增强；在NFATcl表达减少的ECC细胞，RGS10表达显著上调；而在NFATcl表达增多的ECC细胞，RGS10表达显著下调。抑制ECC细胞中NFATcl活性会引起RGS10 mRNA的表达上调；而激活NFATcl活性导致RGS10 mRNA的表达显著下调。 结论：NFATcl基因敲除小鼠心内膜垫区域细胞凋亡增加及主肺动脉瓣膜内皮细胞的增殖不良是最终引起瓣膜发育缺陷、室间隔缺损的原因；FGFR1在NFATcl-1-小鼠胚胎心脏下调极可能是引起内膜垫区域细胞凋亡的重要原因；NFATcl在心脏瓣膜发育中是通过正调节FGFR1和负调节RGS10而发挥作用的。 收起