摘要: EBV与鼻咽癌发病密切相关。在鼻咽癌细胞中，EBV潜伏感染时主要表达两种潜伏膜蛋白LMP1、LMP2，其中LMP1已被确证具有瘤蛋白功能，可以促进B淋巴细胞、上皮细胞转化，使永生化的细胞具有致瘤性。我们已经证实，EB病毒瘤蛋白LMPl可以异常激活AP-1、NFk... 展开 EBV与鼻咽癌发病密切相关。在鼻咽癌细胞中，EBV潜伏感染时主要表达两种潜伏膜蛋白LMP1、LMP2，其中LMP1已被确证具有瘤蛋白功能，可以促进B淋巴细胞、上皮细胞转化，使永生化的细胞具有致瘤性。我们已经证实，EB病毒瘤蛋白LMPl可以异常激活AP-1、NFkB、STAT三条信号转导通路和磷酸化这三条信号通路中的EGFR，JNK，JAK，STAT，IkB，c-Jun等蛋白质分子，影响细胞周期进程，促进细胞的生长发育与分化增殖。 EB病毒瘤蛋白LMP1调节的下游磷酸化蛋白质分子，重要的信号分子或下游功能效应蛋白质分子，远远没有得到全面地阐明。我们前期利用磷酸基团金属离子亲和层析(PMAC)技术富集磷酸化蛋白质策略，结合蛋白质组学高通量技术，在LMP1介导AP-1、NFkB和STAT三条信号转导通路的基础上，依据生物信息学预测，建立了LMP1介导的信号转导通路虚拟网络，获得了25个新的受LMP1调控的差异磷酸化蛋白质分子，其中包括Op18/stathmin。 确立LMP1通过MAPK与cdc2介导的对Op18/stathmin信号通路，将进一步完善了LMP1信号通路的调控网络，确立Op18/stathmin为LMP1的一个新的效应分子提供分子证据，对阐明LMP1在癌变中的分子机制有重要的意义。 1.LMPl对Op18/stathmin表达与磷酸化调节CNE1是LMP1阴性的鼻咽癌细胞，CNE1-LMP1是稳定表达LMP1的鼻咽癌低分化鳞状癌细胞；LMP1受DOX诱导表达的Tet-on-LMP1-HNE2鼻咽癌细胞；来源于SV40T转化的永生化鼻咽部上皮细胞NP69、NP69-PIMSX、NP69-LMP1的NP69细胞系列。通过不同细胞株的研究表明，鼻咽癌细胞与人永生化鼻咽部细胞，LMP1对Op18/stathmin表达没有影响，也没有时间与剂量依赖性；LMP1显著诱导Op18/stathmin磷酸化水平上调；但在鼻咽部黏膜上皮细胞转化的永生化细胞NP69系列，LMP1诱导Op18/stathmin磷酸化改变不明显。LMP1调节Op18/stathmin主要通过影响Op18/stathmin磷酸化实现的，其对肿瘤细胞与永生化的细胞作用机制可能存在一定的差异。 2.LMP1通过MAPK对Op18/stathmin信号通路的调控在鼻咽癌细胞中，LMP1能否通过MAPK调控Op18/stathmin信号通路。LMPl阴性的CNE1与稳定表达LMP1的CNE1-LMP1鼻咽癌低分化鳞状癌细胞系，通过细胞同步化，特异阻断MAPK信号通路，免疫共沉淀，可溶性与聚合性微管蛋白的萃取，Western-blot分析等方法，研究LMP1对MAPK激酶活性影响，MAPK与Op18/stathmin相互作用的改变，微管动力学变化，及LMP1调控MAPK活性改变与细胞周期的相关性。 研究发现，当细胞绝大部分处于G1/S期，LMP1上调p38、ERK、JNK/MAPK磷酸化，其中ERK磷酸化水平显著升高；当绝大部分细胞处于G2/M期时，与G1/S期刚好相反，LMP1负性调控p38、ERK和JNK/MAPK激酶磷酸化，ERK磷酸化水平下降最为显著。 为了证实Op18/stathmin失稳定微管的活性，我们设计了靶向Op18/stathmin的siRNA重组载体，观察在Op18/stathmin基因表达被抑制情况下，微管动力学的改变。研究发现，RNAi有效抑制Op18/stathmin转录及Op18/stathmin蛋白表达；转染pGCsi.U6/neo/GFP空白质粒与pGCsi.U6/neo/GFP-NON无意义质粒的对照组中，可溶性微管蛋白水平无明显变化，但转染pGCsi.U6/neo/GFP-RNAi质粒的处理组，可溶性微管蛋白水平明显下降。证实，在鼻咽癌细胞中，活性Op18/stathmin促进微管解聚，抑制Op18/stathmin活性表达，将促进微管的稳定。 采用免疫共沉淀方法，确定DZ1阻断LMP1表达的情况下，MAPK与Op18/stathmin相互作用及与LMP1调控关系。结果可见，随DZ1抑制浓度加大，与Op18/stathmin相互作用的MAPK磷酸化水平下降；DZ1阻断可导致可溶性微管蛋白比例增加，聚合性微管蛋白比例减少，与LMP1正性调控MAPK激酶活性，导致Op18/stathmin磷酸化水平增加，失稳定微管活性下降，促进微管聚合作用相一致。由于未经秋水仙胺处理细胞绝大多数处于G1/S期(83.9％)，说明在G1/S期，LMP1通过诱导MAPK激酶表达与磷酸化介导Op18/stathmin磷酸化失活，促进微管聚合，保证间期微管的相对稳定。 PD98059选择性阻断MAPK家族中的主要传导通路ERK/MAPK，随PD98059浓度抑制剂浓度增加，P-Op18水平有所下降，微管解聚，聚合性微管蛋白比例下降。 在G1/S期，LMP1通过MAPK介导正性调控Op18/stathmin信号；在G2/M期，LMP1通过MAPK介导负性调控Op18/stathmin的信号；在MAPK家族，LMP1主要通过ERK/MAPK介导影响Op18/stathmin信号，是主要的调控途径。G2/M期，LMP1负性调节MAPK活性机制有多种可能性，如ode2、p53等的参与。 3.LMP1通过cdc2调控Op18/stathmin信号通路 由于Op18/stathmin信号传导与细胞周期密切相关，而cdc2是一种有丝分裂期依赖激酶，细胞周期的正向调控子，我们进一步检测cdc2活性变化与LMP1相关性，探索LMP1通过cdc2介导Op18/stathmin信号通路的调控。 采用M期细胞同步化处理，cdc2激酶活性分析，免疫共沉淀分析cdc2与Op18/stathmin相互作用，微管动力学分析与免疫荧光分析等发现，LMP1不影响cdc2表达；M期，LMP1显著上调cdc2的Thr161磷酸化与cdc2激酶活性，Op18/stathmin磷酸化水平同步升高。CO-IP-Westem-blot分析发现，LMP1促进cdc2与Op18/stathmin相互作用，这种相互作用在M期被显著增强；免疫荧光与Western-blot分析发现，有丝分裂期，LMP1诱导纺锤体微管形成，与Op18/stathmin磷酸化失活，促进微管聚合作用相一致。特异性靶向LMP1的脱氧核酶抑制剂DZ1抑制LMP1表达后，cdc2激酶活性下调，cdc2与Op18/stathmin相互作用减弱，聚合性微管蛋白比例下降；CDK1阻断剂Purvalanol A能有效抑制cdc2激酶活性，抑制Op18/stathmin磷酸化，促进微管解聚，进一步说明LMP1可以通过cdc2介导调节Op18/stathmin信号通路。 小结： 我们采用鼻咽癌细胞为模型，采用细胞同步化，可溶性与聚合性微管蛋白萃取，免疫荧光，Western-blot分析等技术，结合信号传导中信号阻断策略，研究LMP1对Op18/stathmin信号通路的调控，取得了如下发现： 1)LMP1不影响Op18/stathmin表达，但上调Op18/stathmin磷酸化。对鼻咽部上皮细胞转化的永生化细胞NP69系列影响不明显，提示在鼻咽癌细胞与鼻咽部黏膜上皮细胞，LMP1调节Op18/stathmin信号通路机制可能存在差异。 2)在鼻咽癌细胞，首次证明LMP1对MAPK活性调控与细胞周期相关联。在G1/S期，LMP1正性调节MAPKs系列激酶；在G2/M期，负性调节MAPKs激酶活性，其中ERK/MAPK是其主要的调控途径；靶向Op18/stathmin的RNAi实验证实，Op18/stathmin在NPC细胞是一种微管失稳定活性分子，抑制Op18/stathmin的表达，会促进微管聚合。在G1/S期，LMP1促进MAPK与Op18/stathmin相互作用。LMP1通过MAPK介导的Op18/stathmin信号通路的调控，主要发生在G1/S期，与间期的微管稳定性有关。 3)LMP1对细胞周期正向调控因子cdc2的表达无影响，但LMP1能上调cdc2的Tbr161的磷酸化水平，促进M期cdc2激酶活性显著上升；在M期，LMP1诱导Op18/stathmin磷酸化水平显著上升，与cdc2激酶活性改变一致；LMP1促进cdc2与Op18/stathmin相互作用，促进有丝分裂期纺锤体微管的聚合。LMP1通过ode2介导的Op18/stathmin信号通路的调控，主要发生在M期，与有丝分裂期纺锤体形成有关。 以上结果证明：LMP1能通过MAPKs与cdc2激酶调控Op18/stathmin信号通路，影响微管聚合与解聚的动态平衡，这种作用与细胞周期密切相关，具有细胞周期特异性。两条信号通路作用机制不一样，其调控的生物学效应也有差异，在细胞间期，LMP1主要通过MAPK正性调控Op18/stathmin信号通路，维持间期微管的稳定；在M期，LMP1通过上调cdc2激酶活性调控Op18/stathmin信号，促进有丝分裂期纺锤体形成。这两条新的信号通路进一步完善了LMP1的调控网络，对阐明LMP1在癌变的分子机制提供了更多的依据。 收起