摘要: 生物控制矿化作用所产生的磁性颗粒具有粒度小而均匀，不团聚，纯度高，结晶完美，磁性质独特，无细胞毒性等特点，是一种理想的生物纳米磁性材料。趋磁细菌(Magnetotactic bacterium)中形成的纳米磁性颗粒正是生物矿化作用的典型代表。而本课题组首次... 展开 生物控制矿化作用所产生的磁性颗粒具有粒度小而均匀，不团聚，纯度高，结晶完美，磁性质独特，无细胞毒性等特点，是一种理想的生物纳米磁性材料。趋磁细菌(Magnetotactic bacterium)中形成的纳米磁性颗粒正是生物矿化作用的典型代表。而本课题组首次从氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)中发现了生物控制矿化作用所产生的磁小体，本文对氧化亚铁硫杆菌中磁小体的形成进行了研究。本文从磁敏感氧化亚铁硫杆菌的筛选分离出发，建立了氧化亚铁硫杆菌中磁小体提取纯化的方法，研究了不同培养条件下磁小体的形成情况，并分析了磁小体的基本属性。利用生物信息学方法对氧化亚铁硫杆菌标准菌株ATCC23270的全基因组进行分析，得到了一些与趋磁细菌中磁小体形成相关基因同源的基因，并利用实时定量PCR技术对部分基因在不同铁源刺激下的差异表达情况，分析了这些基因在氧化亚铁硫杆菌磁小体形成过程中的作用，最后还对氧化亚铁硫杆菌中磁小体的功能进行了探讨。 本论文创立了固体平板磁泳的方法，并利用该方法从云南东川某酸性矿坑水中分离得到一株磁敏感的氧化亚铁硫杆菌YN-3。经过磁泳分离后，细菌中含磁性颗粒的细胞比例由原始菌群的30％上升到90％，胞内含有的磁颗粒数目也由1～2颗增加至2～5颗。YN-3能以硫单质和硫酸亚铁作为能源，在以硫酸亚铁为能源生长时其胞内能生成黑色电子致密颗粒即磁小体，这些磁小体散落在细胞内，未成链状排列，而在缺铁条件下硫培养时和加入FeCl3的硫培养时均没有磁小体形成。含有磁小体的细胞具有一定的趋磁性，在人工磁场下会向永久磁铁进行趋向运动，而在地磁场下没有明显的定向运动趋势。 本文从氧化亚铁硫杆菌中提取并进行纯化，获得了较高纯度的磁小体颗粒，研究了YN-3中磁小体的基本性质。研究结果表明YN-3中生成的磁小体形态基本为球状，分散性好不团聚，主要由Fe和O两种元素构成，推测其成分为Fe3O4，70％以上的磁小体粒径在60nm-90nm之间，形状粒度都较为均一。 本文通过对氧化亚铁硫杆菌标准菌株ATCC23270的全基因组的生物信息学分析，并在ATCC 23270的全基因组上找到了编码蛋白分别与趋磁细菌中MpsA、Iron Reductase(Thy)、MagA、MamB、Bfr、MarnE、MamK、MamH蛋白同源的八个开放阅读框(ORF)，在ATCC23270全基因组序列上分别对应为ORF1622、0276、1124、2572、1403、1439、1143、2403。本文对其中与趋磁细菌中基因mpsA、thy、magA、mamB、bfr具有较高相似度的ORF1622、0276、1124、2572、1403为目标基因进行了保守结构域、氨基酸序列比对、蛋白质同源性分析，分析结果表明ORF1622编码的蛋白含有PRK05724结构域，与MpsA序列相同度为48％，与acetyl-CoA carboxylase carboxyltransferase subunit alpha同源，认为其与细胞质膜内陷形成磁小体膜有关；ORF0276编码的蛋白含有cycM结构域，与Iron Reductase(Thy)序列相同度为40％，与cysteine synthase B同源；ORF1124编码的蛋白含有KefB、TrkA N和TrkA_C结构域，与MagA序列相同度为32％，与sodium hydrogen exchanger同源，认为其与铁离子的转运有关；ORF2572编码的蛋白含有MMT1结构域，与MamB序列相同度为29％，与cation effiux family protein同源，认为其与铁离子的转运有关；ORF1403编码的蛋白含有Bacterioferritin结构域，与Bfr2序列相同度为26％，与Bacterioferritin同源，认为其与Fe+氧化成核有关。其中mpsA基因、thy基因、magA基因、bfr基因均不在趋磁细菌的磁小体合成基因岛上，在ATCC 23270的全基因组上也未发现与趋磁细菌中磁小体合成基因岛类似的染色体区域。趋磁细菌中较为保守的mamAB cluster、mamDC cluster和Mms系列蛋白(磁小体膜蛋白)在ATCC 23270的全基因组上均没有发现匹配的序列。因此，本文推测氧化亚铁硫杆菌中磁小体的形成机制与趋磁细菌可能是不同的，仅是其中部分与铁转运成核相关的途径具有相似之处。 本文利用实时定量PCR技术从转录水平研究了mpsA、Thy、magA和mamB四基因在硫培养条件下分别用20mM的FeCl3和FeSO4·7H2O刺激下的差异表达以验证它们在磁小体形成过程中的作用。研究结果表明氧化亚铁硫杆菌中的mpsA、magA和mamB基因在转录层面的表达与亚铁有着直接关系，而氧化亚铁硫杆菌仅在亚铁培养下生成磁小体，并且这三个基因在趋磁细菌磁小体形成过程中在铁转运成核方面发挥了重要作用，本文认为它们与氧化亚铁硫杆菌中的磁小体形成相关。 通过比较氧化亚铁硫杆菌与趋磁细菌所形成磁小体功能方面的差异，本文认为氧化亚铁硫杆菌与趋磁细菌仅是具有类似的胞内磁性颗粒，但其生物矿化过程却经历了不同的生化途径；并且结合氧化亚铁硫杆菌特殊的生存环境，本文推测氧化亚铁硫杆菌中磁小体具有铁存储功能，在降低胞内铁浓度，减少亚铁对细胞的毒害，维持氧化亚铁硫杆菌细胞中铁元素的动态平衡等方面发挥了重要的作用。 收起