摘要: 目的：探讨人脂肪间充质干细胞的分离、培养方法，研究其生物学特征及诱导分化成软骨细胞的能力。 方法：取吸脂术后废弃脂肪，酶消化法获取细胞，于含10％新生牛血清的低糖DMEM培养基中进行原代及传代培养。流式细胞术检测第6代细胞表面抗原CD29和... 展开 目的：探讨人脂肪间充质干细胞的分离、培养方法，研究其生物学特征及诱导分化成软骨细胞的能力。 方法：取吸脂术后废弃脂肪，酶消化法获取细胞，于含10％新生牛血清的低糖DMEM培养基中进行原代及传代培养。流式细胞术检测第6代细胞表面抗原CD29和CD44的表达情况。对第6代细胞进行成软骨细胞诱导，诱导培养基为高糖DMEM，含1％新生牛血清、10μg/L TGFβ1、6.25mg/L转铁蛋白、1×10-7mol/L地塞米松和50mg/L维生素C。观察脂肪间充质干细胞的生长情况、形态变化。于诱导14天时应用阿尔新兰染色、甲苯胺兰染色、番红0染色、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色、Aggrecan免疫荧光染色了解其分化成软骨细胞的能力。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测脂肪间充质干细胞诱导0天、14天时Ⅱ型前胶原的基因表达情况。蛋白印迹试验(Western-blot)检测脂肪间充质干细胞诱导0天、14天时Ⅱ型胶原蛋白和Aggrecan蛋白的表达情况。 结果：原代培养后24小时少量圆形及多角形细胞开始贴壁生长，48-72小时贴壁细胞数量增多并以短梭形和多角形为主，5天时细胞形态呈长梭形，10-12天细胞融合达90-100％。传代细胞贴壁时间较原代细胞缩短，6小时80％细胞完成贴壁，6天左右细胞单层融合。传3代后细胞形态均呈长梭形。10代以后细胞出现椭圆形、短梭形样变，停止生长并逐渐脱壁。流式细胞术检测第6代细胞有91％表达CD44，98％表达CD29。在诱导培养基作用下，脂肪间充质干细胞生长增殖减慢，形态由长梭型渐变为三角形、多角形，14天时部分细胞聚集成软骨细胞特有的铺路石样改变。诱导培养基作用下14天时阿尔新兰、甲苯胺兰、番红0、Ⅱ型胶原蛋白免疫组化、Aggrecan免疫荧光等染色均呈阳性。RT-PCR检测0天时前Ⅱ型胶原基因呈阴性表达，14天时呈阳性表达。Western-blot检测在脂肪间充质干细胞诱导后0天时Ⅱ型胶原、Aggrecan的蛋白为阴性表达，14天时为阳性表达。 结论：可从吸脂术来源的脂肪组织中分离培养出脂肪间充质干细胞，其具有较强的增殖能力，可为组织工程提供大量表型稳定的种子细胞，符合组织工程种子细胞的基本条件。在以TGF为主要诱导成分的培养基作用下人脂肪间充质干细胞可以向软骨细胞分化。 收起