摘要: 目的:研究人巨细胞病毒(HCMV)感染人胚肺成纤维细胞(HELF)后对其细胞周期及复制前复合物(pre-RC)的影响。探讨HCMV感染的发病机制。 方法: 1、血清饥饿法同步化HELF于G0/G1期，用HCMV感染同步化的HELF作为感染组(细胞数=1×106)，同时设模拟感染... 展开 目的:研究人巨细胞病毒(HCMV)感染人胚肺成纤维细胞(HELF)后对其细胞周期及复制前复合物(pre-RC)的影响。探讨HCMV感染的发病机制。 方法: 1、血清饥饿法同步化HELF于G0/G1期，用HCMV感染同步化的HELF作为感染组(细胞数=1×106)，同时设模拟感染组为对照组(细胞数=1×106)。用倒置相差显微镜观察两组细胞形态学变化至感染后7天，于感染后12、24、48、72和96小时收获细胞。 2、流式细胞仪检测HELF细胞周期。 3、免疫细胞化学法检测两组HELF细胞核内HCMVIE172蛋白，Cdt1蛋白水平。 4、提取总RNA，用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测两组HELF复制前复合物Cdt1 mRNA、Cdc6 mRNA、Mcm2 mRNA、Mcm8 mRNA的表达水平。 5、RT-PCR法检测两组HELF复制抑制因子Geminin的表达水平。 结果: 1、两组HELF细胞形态学变化：感染组HELF感染后72h时即可见局部细胞变圆，膨胀，细胞体及细胞核巨大化，7天时可见所有细胞均发生病变；模拟感染组HELF各时间点均未见细胞形态学改变。 2、两组HELF HCMVIE172蛋白阳性产物表达：感染组HELF于感染后12h时细胞核内即出现呈棕黄色颗粒的HCMVIE172蛋白产物的表达；模拟感染组HELF各时间点均未出现HCMVIE172蛋白阳性产物。 3、两组HELF细胞周期检测结果：感染组在感染后12h时有70.4％的细胞处于G1期，24h时有69.9％的细胞处于G1期；模拟感染组在感染后12h时有65.7％的细胞处于G1期，24h时有43.8％的细胞处于G1期。感染组HELF停滞G1期于较模拟感染组明显增多，两组比较，差异均有统计学意义。 4、两组HELF Cdt1 mRNA表达水平：模拟感染组在感染后12h时Cdt1 mRNA表达水平最高，后逐渐下降，至72h时达最低水平，96h时又稍有回升。感染组在感染后12h时Cdt1 mRNA表达水平较低，24h时稍有升高，48h达最高峰，72h时开始下降，96h时大致维持72h水平。两组比较，12h、24h和48h时Cdt1 mRNA表达水平差异均有统计学意义，12h和24h时感染组较模拟感染组明显降低，48h时感染组较模拟感染组明显升高。模拟感染组Cdt1 mRNA表达水平的高峰出现在感染后12h，而感染组的高峰则出现在感染后48h，较模拟感染组明显滞后。 5、两组HELF Cdt1蛋白水平：12h、24h、和96h时两组HELF Cdt1蛋白水平差异均有统计学意义，48h、72h时两组HELF Cdt1蛋白水平差异无统计学意义。12h和96h时感染组较模拟感染组明显降低，24h时感染组较模拟感染组明显升高。模拟感染组在感染后12h时Cdt1蛋白表达水平最高，后逐渐下降，至24h时达最低水平，96h时又稍有回升；感染组在感染后12h时Cdt1蛋白表达水平较低，24h时达到最高峰，48h时急剧下降，一直维持较低的稳定水平。 6、两组HELF Cdc6 mRNA表达水平：12h、24h、48h、72h和96h时两组HELF Cdc6 mRNA表达水平差异均有统计学意义，12h、24h和48h时感染组较模拟感染组明显增加，72h和96h时模拟感染组较感染组明显升高。感染组在感染后12h时Cdc6 mRNA表达水平最高，后逐渐下降，至72h时达最低水平，96h时又稍有回升；模拟感染组在感染12h时Cdc6 mRNA表达水平最高，后逐渐下降，至48h时达最低水平，72h后开始回升，96h时继续回升。 7、两组HELF Mcm2 mRNA、Mcm8 mRNA表达水平：12h、24h、48h、72h、96h时两组HELF Mcm2 mRNA、Mcm8mRNA表达水平差异均有统计学意义，12h和24h时感染组表达水平低于模拟感染组，48h、72h、96h时感染组表达水平明显高于模拟感染组。模拟感染组Mcm2 mRNA、Mcm8 mRNA表达水平的高峰出现在感染后24h，而感染组表达水平的高峰则出现在感染后48h，较模拟感染组有明显滞后。 8、两组HELF Geminin mRNA表达水平：12h、24h、48h和72h时两组HELF Geminin mRNA表达水平差异均有统计学意义，12h和24h时感染组较模拟感染组明显增加，48h和72h时感染组较模拟感染组明显降低。感染组在感染后12h时Geminin mRNA表达水平最高，模拟感染组在感染后48h达最高峰。 结论: 1、人巨细胞病毒感染人胚肺成纤维细胞后在其细胞核内进行复制、增殖。 2、人巨细胞病毒感染阻滞了人胚肺成纤维细胞周期，使大部分细胞停滞在G1期。 3、人巨细胞病毒IE172蛋白的表达提示人巨细胞病毒的早期感染。 4、人巨细胞病毒感染使人胚肺成纤维细胞复制前复合物主要成份Cdt1 mRNA、Mcm2 mRNA、Mcm8 mRNA的表达水平迟滞、Cdt1蛋白表达延迟。Cdc6 mRNA高水平表达。 5、人巨细胞病毒感染能诱导人胚肺成纤维细胞复制抑制因子Geminin异常表达，使Geminin/pre-RC平衡失调，阻止复制前复合物的形成，DNA合成障碍。这可能是人巨细胞病毒感染导致人胚肺成纤维细胞周期阻滞于G1期的机制。 收起