摘要: 研究背景: 糖尿病肾病(DN)的发病率逐年上升，已成为终末期肾病(ESRD)的主要原因。其重要病理改变就是肾小管间质病变。细胞外基质(ECM)在肾间质过量堆积是其基本病理特征。肾间质肌成纤维细胞(MyoF)是肾间质中产生ECM的主要细胞。在病理条件下，肾... 展开 研究背景: 糖尿病肾病(DN)的发病率逐年上升，已成为终末期肾病(ESRD)的主要原因。其重要病理改变就是肾小管间质病变。细胞外基质(ECM)在肾间质过量堆积是其基本病理特征。肾间质肌成纤维细胞(MyoF)是肾间质中产生ECM的主要细胞。在病理条件下，肾小管上皮细胞可发生上皮细胞-肌成纤维细胞转分化(TEMT)，即丧失原有的上皮细胞表型特征，而获得MyoF的新特征。有研究表明肾小管上皮细胞转分化是肾间质MyoF的重要来源之一，并可能在DN发生发展中起重要作用。深入研究其产生的机制，寻找有效的阻断TEMT的手段，具有重要意义。 在TEMT过程中，转化生长因子-β1(TGF-β1)是重要的启动和促进因子。TGF-β1生物学作用广泛而复杂，具有正面和负面的多样效应。单纯抑制TGF-β1，则可能在抑制TEMT同时带来不利的副作用。寻找其下游作用更特异、有效的因子或环节，成为了新近研究的关注热点。 整合素连接激酶(ILK)是新近发现的一种与整合素细胞内区域结合的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。以往对ILK的研究主要集中在肾小球，近年在UUO模型大鼠和体外细胞培养的研究结果表明，肾间质ECM的聚积与ILK表达正相关；ILK介导TGF-β1/Smad信号传导通路，可能参与TEMT过程。然而，在DN肾小管上皮细胞中ILK表达情况及其与TEMT关系，目前所知尚少。 既然TEMT在糖尿病肾病等慢性肾脏病的纤维化进程中发挥着重要促进作用，那么，如果能通过某些方法干扰或阻止肾小管上皮细胞的转分化过程，则有可能延缓或逆转肾间质纤维化的发生与发展。冬虫夏草作为我国传统中药中的瑰宝，其具有滋阴补肾的肾脏保护作用已为大量的临床实例所证实。冬虫夏草是否能阻抑TEMT，减轻肾间质纤维化从而发挥其肾保护作用?此种作用是否与ILK有关?尚未见相关报道。 本研究拟采用人近端肾小管上皮细胞(HK-2)和糖尿病大鼠模型为研究对象，从体外细胞培养和动物体内实验两个实验层面，采用反映上皮细胞表型特征的E钙粘素(E-Cadherin)、反映MyoF表型特征的α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和作为ECM成分的纤维连接蛋白(FN)等指标，观察在DN小管间质病变中，肾小管上皮细胞转分化与ILK表达的改变，以及TEMT与ILK的关系：并用虫草菌液干预处理，观察虫草菌液对上述过程的影响。旨在从TEMT这一新途径，深入探讨DN发病具体机制及冬虫夏草肾脏保护作用的可能新机制。 方法： (一)细胞实验部分应用细胞培养技术，按下列实验条件分组培养人近端肾小管上皮细胞(HK-2)：正常糖(含5.5mM D-葡萄糖)对照组(N组)；甘露醇(含24.5mM D-甘露醇+5.5mM D-葡萄糖)对照组(M组)；高糖(含30 mMD-葡萄糖)组(H组)；高糖+虫草菌液5μg/ml(H+5C组)；高糖+虫草菌液10μg/ml(H+10C组)；高糖+虫草菌液20μg/ml(H+20C组)。于48h收集各组细胞，免疫印迹方法检测E-Cadherin、α-SMA、FN与ILK的蛋白表达。 (二)动物实验部分雄性Wistar大鼠随机分为正常对照组(N组，n=12)、糖尿病模型组(D组，n=12)和糖尿病虫草菌液干预组(C组，n=12)。采用腹腔内一次注射STZ 55mg·kg-1诱导糖尿病模型。虫草菌液组大鼠于糖尿病成模后，给予虫草菌液1000mg·kg-1·d-1灌胃。分别于第8、16周末，每组随机选取6只大鼠，留24小时尿测定尿蛋白排泄量；处死大鼠，心脏取血测血清肌酐(SCr)、血甘油三酯(TG)和胆固醇(CH)；肾脏原位灌洗后，取肾组织：石蜡切片，HE和Masson染色观察肾小管间质损害及纤维化；免疫组化法检测肾小管上皮细胞E-Cadherin、α-SMA、FN与ILK的表达；免疫印迹方法检测肾组织E-Cadherin、α-SMA、FN与ILK蛋白的表达。 结果: 1.高糖环境下HK-2细胞H组与N组比较，E-Cadherin的蛋白表达减少；ILK、α-SMA、FN蛋白的表达增多。经虫草菌液处理后的各C组与H组比较E-Cadherin的蛋白表达上调，α-SMA、FN及ILK、蛋白表达下调，且与虫草菌液呈剂量依赖性关系。 2.D组和C组糖尿病大鼠的尿蛋白排泄量、肾小管间质损伤指数及间质胶原相对面积等均随病程进展而增加，明显高于同期N组；虫草菌液(C组)能减轻上述病变。16周时C组较同期D组，其肾脏保护作用更显著。 3.D组和C组糖尿病大鼠肾小管上皮细胞E-Cadherin表达随病程逐渐减少，而α-SMA、FN表达逐渐增加，均较同期N组有显著差异；同时，ILK表达也明显上调。ILK与E-Cadherin呈负相关，与α-SMA、FN呈正相关。虫草菌液干预可改善上述变化，16周时C组较同期D组各指标的改善呈现显著差异。 结论: 1.高糖环境下HK-2细胞与糖尿病大鼠肾小管上皮细胞E-cadherin表达减少，α-SMA、FN表达增加，表明在DN肾小管间质病变进程中，存在肾小管上皮细胞转分化(TEMT)。 2.在DN病理状态下，肾小管上皮细胞的ILK表达增高，且与TEMT过程高度相关；ILK参与、介导了DN的TEMT过程，在其中起着正向调控作用。 3.虫菌液草可下调高糖环境下HK-2细胞ILK的表达，阻抑TEMT。 4.虫草菌液能减轻DN肾小管间质病变，下调肾小管上皮细胞的ILK表达，阻抑TEMT，显示出抗纤维化作用。其可能是虫草菌液对DN肾保护作用的重要机制之一。 收起