摘要: 内生真菌(endophyticfungus)是生长在寄生体内不引起植物发病的一类特殊微生物。它们与宿主植物之间存在着一定的“互惠共生”关系，宿主植物为内生菌提供营养需求，内生菌则通过产生次生代谢产物调节并增强宿生植物的环境适应能力，如固氮，抗旱、抗虫... 展开 内生真菌(endophyticfungus)是生长在寄生体内不引起植物发病的一类特殊微生物。它们与宿主植物之间存在着一定的“互惠共生”关系，宿主植物为内生菌提供营养需求，内生菌则通过产生次生代谢产物调节并增强宿生植物的环境适应能力，如固氮，抗旱、抗虫和抗病等；内生真菌还能够参与植物活性成分的合成，或者对植物次生代谢产物进行转化。 禾本科植物狗牙根(Cynodondactylon)为我国传统的止血、消炎、抗菌中草药，在我国沿海的盐生地区广泛生长，生长过程中几乎不发生植物病害，采收后也很容易保藏。为此，我们从新鲜狗牙根中分离到92株内生真菌，并从中筛选到一株抗真菌活性很强的Calcarisporiumsp.0083菌株。本课题采用先进的生物活性测定方法、微生物发酵技术及TLC、HPLC、LC-MS等手段对该菌及其次生产物抗菌活性、抗饲料霉变、拮抗植物采后病害等生物功能与机理，以及细胞生长与代谢调控等作了系统的研究。本课题的研究结果如下：10083菌次生产物(endophyticcultureextract，ECE)抗霉菌与饲料霉变的研究1.1ECE对8株供试霉菌的抑菌效果 以我国南方饲料中常见的Aspergillusflavus，A.niger，Penicilliumcitrinum等8株霉菌作为靶菌；以工业常用的饲料防霉剂丙酸(propionicacid，PPA)作为阳性对照。实验结果表明，ECE具有与PPA相当的抗饲料霉菌作用，且量效关系显著；各靶菌对ECE的敏感性不同，其中镰刀霉F.moniliforme表现了最强的抗性，各靶菌敏感强弱次序为：Fusariumsp.＞Aspergillusspp.＞Penicilliumspp.；供试曲霉菌对ECE的敏感强弱次序为：A.rubber＞A.flavus≥A.niger＞A.glaucus；供试青霉对ECE的敏感性的强弱次序为：P.citrinum＞P.purpurogenum＞P.rugulosum。 1.2ECE抑制饲料霉变及黄曲霉毒素合成的作用取不同湿含量的蛋鸭全价颗粒饲料(不合任何添加剂)，分别添加1.0％、1.5％的ECE和PPA，以测定ECE对饲料贮藏防霉的效果及其对黄曲霉毒素的抑制作用。结果表明，在各种湿度环境下，ECE能明显地抑制饲料中的各种霉菌的生长。特别在高湿度环境下，1.0％浓度的ECE比0.5％的PPA抗饲料霉变的效果好，其中对曲霉菌的抑制率最高，(＞89％)，其次是对青霉菌的抑制(＞74％)和对镰刀霉的抑制(＞62％)。尽管高湿度环境有利于饲料样品中霉菌的生长和黄曲霉毒素的产生，但在3种实验湿度下，污染了霉菌并贮藏1个月的商业饲料在ECE(1.0％及以上添加量)的作用下，黄曲霉毒素被较大程度的抑制，贮藏湿度对抑制率的影响较小，说明高湿度环境对ECE的功效影响不大。 2Calcarisporiumsp.0083菌拮抗植物病原真菌及其病害的研究2.10083菌孢子对植物病原菌孢子萌发的抑制作用在0083菌的作用下，5种供试果蔬病原真菌的体外孢子存活率均有下降趋势。与阴性对照相比，0083菌抑制5种果蔬病害菌的作用显著(p＜0.05)，且抑制活性与0083菌孢子的浓度有量效关系。在108cfu/ml的浓度下，0083菌对5种供试病原菌孢子萌发的抑制率均超过了70％，其中对B.cinerea和A.alternata孢子萌发的抑制活性最强，分别达到了85.3％和84.1％，说明B.cinerea和A.alternata对0083菌株的敏感性最强。 体内活性实验通过监测离体果蔬人工病害的日扩展情况得以实现。果蔬病斑的被抑制率(IR)值表明，0083菌在果蔬体内拮抗病原菌孢子萌发的作用明显。与阴性对照相比，105cfu/ml及以上浓度的0083菌孢子悬浮液能不同程度地有效抑制果蔬病斑的发展(p＜0.05)，且浓度与抑制率之间有明显的量效关系。5种供试真菌对0083菌显示了不同的抗性，其中B.cinerea抗性最差，在10％fu/ml的0083菌孢子作用下，其病斑被抑制了88.2％，其次为A.alternata，被抑制了83.8％；抗性最强的病原菌为P.obscurans，其所诱发的病斑也有70.5％被抑制。 2.20083菌发酵液拮抗植物病原真菌的作用皿内实验表明0083菌株发酵液可有效抑制供试果蔬病菌的孢子萌发和菌丝生长。与阴性对照相比，0083菌发酵液对各供试病原真菌的孢子萌发有显著抑制作用。各供试病原菌对0083菌发酵液的抗性趋势与其对0083菌孢子的抗性趋势一致，即B.cinerea孢子对0083菌发酵液最为敏感，其萌发率仅为18.6％，P.obscurans孢子的抗性最强，最终有46.9％的萌发率。0083菌孢子对供试病原菌孢子萌发的抑制作用要比发酵液的抑菌作用弱，提示0083菌拮抗植物病原菌的功能相当程度上依靠其代谢过程产生的次生代谢产物。 0083菌发酵液皿内拮抗果蔬病原菌菌丝生长的结果表明，0083菌发酵液对各供试病原菌菌丝的生长都有不同程度的抑制作用。其中对B.cinerea菌丝生长的抑制作用最强，抑制率达到了89.8％，对P.obscurans菌丝生长的抑制率最低，也达到了60.4％。 体内活性实验结果表明，0083菌可有效抑制离体果蔬上人工病害的扩展。与上述体外实验结果类似，B.cinere和A.alternata对0083菌发酵液最为敏感，病斑被抑制的程度均超过了75％；同样，0083菌的发酵液对果蔬病害的抑制作用明显强于同浓度的活菌的抑制作用。 2.3接种方法对离体果蔬人工病害的影响不同接种方式对离体果蔬人工病害的影响显著。当先被接种时，Calcarisporiumsp.0083对果蔬病原菌的生物防治作用更有效。当防治菌先接种6h时，在接种病原真菌3天后，对照组的病斑已扩展到31.4～43.7mm，而实验组的病斑扩展仅为3.3～5.1mm，抑制率近乎达到90％；当防治菌后接种4h，则病害的扩展与对照组无明显差异。方差分析表明，只要0083菌被提前或同时与病原真菌接种，其对果蔬病害的抑制效果无明显差异。该实验结果为Calcarisporiumsp.0083菌应用于防治果蔬病害或果蔬防腐的具体方式提供了实践证明。 2.40083菌拮抗果蔬病原真菌的机制对峙培养曲线表明，0083菌对供试病菌的生长有显著的抑制作用。培养初期，0083菌的生长速率要快于2株供试病原真菌的生长速率。约4天后，两菌落开始相交，0083菌开始包围病原菌落，因而病原菌落被覆盖，从而生长受到抑制，面积不再扩展，菌落的生长半径Rp明显低于对照组菌落直径Rc，菌落逐渐萎缩。可见，0083菌与果蔬病原真菌之间产生了营养竞争，结果使果蔬病原真菌受到明显的抑制，整个平板最终为0083菌所占据，并形成大量的绿色孢子。在两菌的相交界面处还可观察到一条清晰的拮抗带，说明产生了某种抗生物质。但在培养的后期(约9天)，0083菌开始自溶，菌落也出现萎缩现象。 挑取对峙培养交界面上的菌丝块镜检，镜下可见0083菌的菌丝以各种方式寄生于病菌菌丝上，如与病菌丝平行生长，并形成枝状附着胞吸附且侵入病菌丝；有的缠绕在病菌菌丝上，穿入病菌菌丝并在其上生长；病菌菌丝原生质变稀薄甚至消失；菌丝变细，在分隔处断裂；同时，0083菌丝寄生于病菌菌丝上，使病菌的菌丝尖端发生畸变而不能正常生长。因此可认为，狗牙根内生真菌0083对果蔬病原真菌的重寄生作用是其拮抗果蔬病原真菌的重要作用机制。 30083菌生长与抗菌活性的代谢调控以0083菌为出发菌株，通过单因素实验和正交优化实验，在摇瓶条件下对出发菌株的发酵培养基组成(碳源、氮源等)和工艺条件(发酵温度、初始pH值、供氧量)进行了摸索。结果表明，菌体生长和发酵生产抗菌产物的最佳培养基为改良PDA培养基，最适碳源为葡萄糖2％，最适N源为蛋白胨2％，C/N比1：1；最适发酵温度28℃，最适发酵时间3天(72h)，最适装液量100ml/500ml三角瓶，最适初始pH值为6.5，最适摇床转速160rpm。在摇瓶试验的基础上，对该菌发酵产抗菌物质作了初步放大试验(10L全自动发酵罐)，得到0083菌发酵过程的动态曲线，所得产物最大抑菌圈达到15.8mm。动态曲线反映了在最适发酵时间内，发酵液的pH值、DO值、残糖的降低趋势及生物量和抗菌产物量的上升趋势。 本课题的创新点及意义如下：首次将内生真菌Calcarisporiumsp.0083的次生代谢产物在饲料防霉中进行了应用研究；首次将该菌株应用于果蔬致病真菌的拮抗及其病害的防治，并进行了机制研究；首次对该菌株进行了生长与代谢条件的调控与优化，并在10升全自动发酵罐中得以放大，得到发酵过程的动态曲线，为该菌工业化生产新型生物农药及防腐抗菌剂奠定了理论和应用基础。 收起