摘要:
该论文对哺乳动物pol δ的结构、亚基组成以及pol δ结合蛋白PDIP38的功能进行了研究.我们采用该实验室独有的pol δ p125单克隆抗体免疫亲和层析柱,再结合其它传统层析方法来分离纯化牛胸腺和Hela细胞的pol δ,通过Superose 6分子筛层析、甘油梯度离心的...
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该论文对哺乳动物pol δ的结构、亚基组成以及pol δ结合蛋白PDIP38的功能进行了研究.我们采用该实验室独有的pol δ p125单克隆抗体免疫亲和层析柱,再结合其它传统层析方法来分离纯化牛胸腺和Hela细胞的pol δ,通过Superose 6分子筛层析、甘油梯度离心的方法来研究pol δ的亚基组成;通过不同的重组病毒感染真核细胞以构建不同亚基组成的pol δ的方法来研究pol δ的p12亚基的功能;采用不同的盐浓度来洗脱与p125单克隆抗体免疫亲和层析柱结合的蛋白质,看是否能从pol δ复合物中发现一些令人感兴趣的未知的pol δ结合蛋白.在对PDIP38功能进行研究时,我们构建、表达了重组人GST-PDIP38全长和缺失突变体蛋白,用纯化了的重组人GST-PDIP38全长和缺失突变体蛋白、重组人His-PDIP38蛋白和多种天然和重组的po1 δ,通过poly dA oligo dT和poly(dA-dT)assay等方法研究PDIP38对pol δ DNA聚合活性的影响;通过体外GST pull down 实验确定了PDIP38与po1 δ p125、p50亚基和PCNA的结合位点;利用重组病毒在昆虫细胞体内构建His-PDIP38/p125、His-PDIP38/p50和His-PDIP38/PCNA复合物,来确定PDIP38与pol δ p125、p50亚基和PCNA在体内的结合情况;此外,还利用免疫荧光染色法观察PDIP38在细胞内的定位,探索PDIP38在细胞内的功能.我们的研究达到了预期的目的,并取得了很多新成果,主要的实验结果如下:1.从He1a细胞和小牛胸腺纯化得到的pol δ和重组人pol δ一样,都是异四聚体单聚物,p68可能是影响其迁移率的主要因素.2.以po1y dA·oligo dT和poly(dA-dT)为模板时,重组polδ的三亚基复合物(p125/p50/p12)和四亚基复合物(p125/p68/p50/p12)的DNA聚合活性无显著差异,但另一种组合的三亚基复合物(p125/p68/p50)的活性则低很多,而且单独加p12亚基到从小牛胸腺纯化的p125/p50复合物中,可以增加p125/p50核心酶的DNA聚合活性.3.首次发现Hela细胞内的po1 δ可形成两个具有DNA聚合酶活性的复合物,PCNA、cdc2/cdkl、Cyclin E等与细胞周期有关的蛋白及功能未知的PDIP46存在于较低盐浓度洗脱下来的pol δ复合物中;参与DNA修复的Ku70和Ku80蛋白存在于较高盐浓度洗脱下来的pol δ复合物中;而p21蛋白和功能未知的PDIP38在两个pol δ复合物里都检测到.4.首次确认pol δ的p50、p125亚基和PCNA与PDIP38的结合位点,分别位于PDIP38的C-末端243-368、N-末端1-125和C-末端122-368的氨基酸区域.而PDIP38与pol δ的p50亚基的结合位点则在于p50的C-末端252-400的氨基酸区域.5.首次发现PDIP38可以抑制天然和重组人pol δ的活性.PDIP38可能通过抑制PCNA和p50而达到抑制pol δ活性的作用.PDIP38经PCNA途径的抑制作用是可逆的,增加PCNA的量可逆转PDIP38对pol δ的抑制;PDIP38经p50途径的抑制作用是不可逆的,增加p50的量不可逆转PDIP38对pol δ的抑制.6.确定了PDIP38 C-末端243-368的氨基酸区域是PDIP38重要的蛋白质结合和抑制功能区域.7.首次利用免疫荧光染色法定位了293细胞内的PDIP38和pol δ p50亚基,发现PDIP38存在于293细胞的胞浆和胞核内,在胞浆的PDIP38的量要比胞核的多;pol δ p50亚基主要位于胞核内.无论是胞浆还是胞核的PDIP38都与p50位于相同的位置,这表明293细胞内的PDIP38与p50可能有着功能上的联系.我们所取得的这些成果,为进一步研究pol δ的结构和亚基功能提供了实验依据;填补了pol δ结合蛋白PDIP38的研究空白,为研究po1 δ结合蛋白提供了新的思路和方法.
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