摘要: 为获得充足的CD7材料来源,以制备抗CD7基因工程抗体并研究CD7的作用机制,该文进行了以下工作:(1)人CD7膜外区cDNA在大肠杆菌中的表达,并对表达的融合蛋白进行了纯化.(2)人CD7在哺乳类细胞中的表达并对其在LPS信号传递及细胞凋亡中的作用进行探讨.主要... 展开 为获得充足的CD7材料来源,以制备抗CD7基因工程抗体并研究CD7的作用机制,该文进行了以下工作:(1)人CD7膜外区cDNA在大肠杆菌中的表达,并对表达的融合蛋白进行了纯化.(2)人CD7在哺乳类细胞中的表达并对其在LPS信号传递及细胞凋亡中的作用进行探讨.主要研究内容及结果:1.CD7膜外区cDNA在大肠杆菌中的表达及重组融合蛋白的纯化;(1)通过PCR调整CD7膜外区cDNA的阅读框架,使之与生物素化蛋白基因的阅读框架一致.缺失了编码CD7信号肽的核甘酸序列,并增加了一个大肠杆菌偏性终止密码子.(2)将阳性重组子转入大肠杆菌DH5 α,用IPTG诱导重组融合蛋白的表达.2.人CD7在哺乳类细胞中的表达及其功能探讨;(1)根据Genebank数据库中人CD7 cDNA序列,设计并合成一段引物,通过PCR法从含CD7的质粒中扩增得到了CD7全长cDNA,扩增片段经XhoI、XbaI酶切后,同经相同酶切的线性化质粒pcIneo、pcDNA3连接构建了重组真核表达载体pcIneo-CD7、pcDNA3-CD7. (2)通过电穿孔和磷酸钙法将重组质粒pcDNA3-CD7和空质粒pcDNA3转染HEK293细胞和Jurkat细胞,在有G418的条件下培养2~3周,筛选出G418抗性克隆,用RT-PCR和FCM对G418抗性克隆细胞进行分析.(3)LPS分别刺激HEK293/CD7细胞和HEK293后,用夹心ABC-ELISA法检测细胞上清中IL-8含量.(4)PHA分别刺激CD7<'+>Jurkat和CD7<'-> Jurkat细胞,通过FCM检测CD7<'+>Jurkat和Jurkat的凋亡程度.(5)表达CD7分子的哺乳类细胞模型的建立为进一步探讨CD7的功能提供了良好的实验材料. 收起