摘要: 第一部分机械力学刺激对MG-63成骨样细胞增殖分化的影响 目的：观察机械力学刺激对MG-63成骨样细胞增殖分化的影响。 方法：人成骨肉瘤MG-63细胞株购自美国培养物保存中心(ATCC号：CRL1427)。采用根据四点弯曲原理设计的细胞加力装置，分别采用... 展开 第一部分机械力学刺激对MG-63成骨样细胞增殖分化的影响 目的：观察机械力学刺激对MG-63成骨样细胞增殖分化的影响。 方法：人成骨肉瘤MG-63细胞株购自美国培养物保存中心(ATCC号：CRL1427)。采用根据四点弯曲原理设计的细胞加力装置，分别采用不同大小应变值的张应力(0、1000、2000、4000、6000μstrain)以及不同的刺激时间(0、1、3、6、12h)对MG-63样成骨细胞进行力学刺激。用α-磷酸奈酚法测定碱性磷酸酶(ALP)活性；半定量RT-PCR检测Ⅰ型胶原(COL Ⅰ)、骨钙素(OC)、骨桥素(OPN)的mRNA的表达；免疫印迹法检测增殖细胞核抗原(PCNA)、COLⅠ蛋白的表达；用10mmβ-甘油磷酸钠和50μg/ml抗坏血酸诱导MG-63成骨样细胞分化成熟，在这个过程中进行力学刺激，分别在第18天和第24天，用茜素红染色观察矿化结节形成。 结果：当应变值为2000μstrain时，力学刺激对MG-63成骨样细胞PCNA蛋白表达以及ALP活性的促进作用最强。当应变值为2000μstrain时，力学刺激呈时间依赖性明显上调了MG-63成骨样细胞PCNA蛋白、ALP活性、COL Ⅰ蛋白及mRNA、OC mRNA、OPN mRNA的表达；茜素红染色结果显示，力学刺激组较对照组更加容易形成矿化结节。 结论：适宜的机械力学刺激促进了MG-63成骨样细胞增殖分化指标如PCNA、ALP、COL Ⅰ、OC及OPN等的表达，说明机械力学刺激在成骨细胞增殖分化过程中发挥重要作用。 第二部分机械应力对MG-63成骨样细胞结缔组织生长因子(CTGF)表达影响及机制研究 目的：观察机械力学刺激对MG-63成骨样细胞C17GF表达的影响，对丝裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路(包括ERK、JNK及p38)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶AKT的影响以及MAPK、磷脂酰肌醇3激酶(P13K)信号通路在这一过程中的作用。 方法：用免疫印迹法及免疫细胞化学染色检测CTGF蛋白的表达。MAPK、AKT信号通路的活化也采用免疫印迹法检测。CTGFmRNA表达采用半定量RT-PCR检测。 结果：机械力学刺激促进了MG-63成骨样细胞CTGF的表达，且力学刺激能够激活ERK及JNK信号通路，但对不能使p38信号通路激活。JNK信号通路阻断剂能够阻断应力刺激对CTGF上调作用。应力刺激不能激活AKT 信号通路，但P13K信号通路阻断剂阻断了力学刺激对JNK的活化，并且也阻断了力学刺激对CTGF表达的促进作用。 结论：机械力学刺激通过JNK依赖的信号途径促进了MG-63成骨样细胞CTGF的表达，并且P13K-JNK途径在这一过程中起重要作用。 第三部分机械应力刺激对OPG/RANKL/RANK系统的影响 目的：观察力学刺激对MG-63成骨样细胞护骨素(osteoprotegrin，OPG)及细胞核因子-кB受体活化因子配体(receptor activator ofnuclear factor kappa B ligand，RANKL)的表达，以及对小鼠前破骨细胞RAW264.7细胞核因子-кB受体活化因子(receptor activator ofnuclear factor kappa B，RANK)表达的影响；观察MAPK信号通路在力学刺激引起的OPG表达中的作用；观察力学刺激对RANKL诱导的小鼠前破骨细胞RAW264.7分化的影响。 方法：用免疫印迹法检测MG-63成骨样细胞OPG、RANKL及小鼠前破骨细胞RAW264.7 RANK蛋白的表达。用半定量RT-PCR检测MG-63成骨样细胞OPG mRNA的表达。用50 ng/ml的RANKL诱导RAW264.7细胞6天后，用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色观察TRAP阳性多核细胞(即破骨细胞)。 结果：机械力学刺激明显促进了MG-63成骨样细胞OPG蛋白及mRNA的表达，但对RANKL蛋白的表达没有明显影响。力学刺激能够激活ERK及JNK信号通路，但对不能使p38信号通路激活。ERK信号通路阻断剂能够阻断力学刺激引起的OPG蛋白的表达。力学刺激对小鼠前破骨细胞RAW64.7 RANK蛋白的表达没有明显作用，但力学刺激能够显著抑制RANKL诱导的前破骨细胞RAW264.7的分化成熟。 结论：机械力学刺激促进了MG-63成骨样细胞OPG的表达，并且能够抑制前破骨细胞RAW264.7向成熟破骨细胞的分化，这可能是力学刺激能够促进骨形成、抑制骨吸收的机制之一。 第四部分Integrinβ1/FAK在力学信号转导中的作用 目的：观察整合素-β<,1>(Integrin-β1)在MG-63成骨样细胞增殖分化过程中表达的变化。观察机械力学刺激对MG-63成骨样细胞Integrin-β<,1>表达，以及对粘着斑激酶(Focal adhesion kinase，FAK)信号途径的影响。观察力学刺激对Integrin-β<,1>及FAK之间相互作用的影响，以及Integrin-β<,1>是否介导了力学刺激对FAK及ERK的活化过程。 方法：Imegrin-β<,1>蛋白表达及FAK信号途径活化程度采用免疫印迹法检测。Integrin-β<,1> mRNA的表达采用实时定量PCR检测。用细胞免疫荧光染色显示FAK。用免疫共沉淀法检测Integrin-β<,1>与FAK的相互作用。 结果：在MG-63成骨样细胞增殖分化过程中，Integrin-β<,1>的表达呈现双峰式表达，即在增殖末期及矿化期表达明显增高。机械力学刺激促进了Integrin-β<,1>的表达，并且能够使FAK Tyr397位点发生活化。应用Integrin-β<,1>的封闭性抗体能够阻断力学刺激对FAK及EKK的活化作用。力学刺激促进了Integrin-β<,1>与FAK之间的相互作用。 结论：Integrin-β<,1>介导了机械力学刺激对FAK及ERK的活化过程，integrin-β<,1>/FAK/ERK可能在成骨细胞力学信号转导过程中发挥重要作用。 收起