摘要: 肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)是一种多功能细胞因子，具有在体内外直接杀伤肿瘤细胞的特性，是迄今为止发现的抗肿瘤细胞活性最强的细胞因子。但由于大量全身应用会产生强烈的毒副作用，使其应用于临床抗肿瘤治疗的效果并不理想。... 展开 肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)是一种多功能细胞因子，具有在体内外直接杀伤肿瘤细胞的特性，是迄今为止发现的抗肿瘤细胞活性最强的细胞因子。但由于大量全身应用会产生强烈的毒副作用，使其应用于临床抗肿瘤治疗的效果并不理想。随着肿瘤学和分子生物学技术的飞速发展，应用基因工程技术将人肿瘤坏死因子-α(human tumor necrosis factor-α，hTNF-α)的结构进行改造，达到降低毒副作用、增强抗肿瘤活性、赋予肿瘤靶向等效果，在恶性肿瘤的治疗方面呈现出良好的应用前景。 目的： 1．应用基因工程技术，初步实施hTNF-α靶向改造方案，以期获得同时解决hTNF-α毒副作用和肿瘤靶向性问题的rhTNF-α： 2．构建带有胶原蛋白(collagen)序列，明胶酶(MMP-2和MMP-9)底物序列和hTNF-α突变体基因的2种的pET32a(+)原核表达质粒，并实现在大肠杆菌λDE3中的高效表达； 3．初步确立rhTNF-α融合基因表达产物的纯化方案，获得两种rhTNF-α融合蛋白的初步纯化产物。 方法： 1．重组pGEM-collagen质粒的构建合成人胶原蛋白序列的寡核苷酸DNA单链，退火，克隆到 pGEM-T Easy质粒中，筛选阳性重组子并进行DNA序列分析，筛选出序列正确的质粒并命名为重组pGEM-collagen。 2．重组pMD18-MMP2-hTNF和pMD18-MMP9-hTNF质粒的构建 1)用PCR方法扩增得到带有明胶酶(MMP-2和MMP-9)底物序列和hTNF-α突变体基因的融合基因序列。 2)将扩增产物通过AT克隆法连接至pMD18-T质粒中，转化，筛选阳性克隆。 3)对阳性重组子进行DNA序列分析，获得序列正确的带明胶酶底物序列和hTNF-α突变体基因的重组质粒，分别命名为重组pMD18-MMP2-hTNFpMD18-MMP9-hTNF质粒。 3．重组pGEM-collagen-MMP2-hTNF和pGEM-collagen-MMP9-hTNF克隆质粒的构建 1)将pMD18-MMP2-hTNF和pMD18-MMP9-hTNF质粒分别进行双酶切，目的DNA片段定向插入至pGEM-collagen质粒的胶原蛋白序列下游。 2)对阳性重组子进行DNA序列分析，获得带胶原蛋白、明胶酶(MMP-2和MMP-9)底物序列的rbTNF-α重组质粒，分别命名为重组pGEM-collagen-MMP2-hTNF和pGEM-coUagen-MMP9-hTNF克隆质粒。 4．重组pET-32a(+)-collagen-MMP2-hTNF和pET-32a(+)-collagen-MMP9-hTNF表达质粒的构建 1)将pGEM-collagen-MMP2-hTNF和pGEM-collagen-MMP9-hTNF 质粒与pET-32a(+)表达载体双酶切，连接，转化，筛选。 2)对阳性重组子进行DNA序列分析，筛选出序列正确的克隆并分别命名为重组pET-32a(+)-collagen-MMP2-hTNF和pET-32a(+)-collagen-MMP9-hTNF表达质粒。 5．重组pET-32a(+)-collagen-MMP2-hTNF和pET-32a(+)-collagen-MMP9-hTNF表达质粒在大肠杆菌λDE3中的表达 1)将重组pET-32a(+)-collagen-MMP2-hTNF和pET-32a(+)-collagen-MMP9-hTNF表达质粒，分别转化大肠杆菌λDE3，筛选阳性重组子并进行DNA序列分析。 2)IPTG诱导阳性重组细菌表达目的蛋白。 6．表达产物的提取、纯化 1)按Novagen公司BugBuster His·Bind Purification Kits 试剂盒方法进行融合蛋白的提取和纯化。 2)SDS-PAGE分析表达产物和纯化产物。 结果： 1．应用基因克隆技术，构建了胶原蛋白序列的克隆质粒(重组pGEM-collagen质粒)。 2．构建了明胶酶(MMP-2和MMP-9)底物序列和hTNF-α突变体基因的2种克隆质粒(重组pMD18-MMP2-hTNF和pMD18-MMP9-hTNF质粒)。 3．构建了带有胶原蛋白序列和明胶酶(MMP-2和MMP-9)酶底物序列的rhTNF-α的2种克隆质粒(重组pGEM-collagen-MMP2-hTNF和pGEM-collagen-MMP9-rhTNF质粒)。 4．构建了带有胶原蛋白序列和明胶酶(MMP-2和MMP-9)酶底物序列的rhTNF-α的2种原核表达质粒(重组pET-32a(+)-collagen-MMP2-hTNF和pET-32a(+)-collagen-MMP9-hTNF质粒)。 5．初步确立了重组pET-32a(+)-collagen-MMP2-hTNF和IpET-32a(+)-collagen-MMP9-hTNF质粒在大肠杆菌λDE3中的表达条件，获得两种rhTNF-α融合基因的表达产物。 6．初步确立了重组 pET-32a(+)-collagen-MMP2-hTNF 和 pET-32a(+)-collagen-MMP9-hTNF 融合基因表达产物的纯化方案，获得两种rhTNF-α融合蛋白的初步纯化产物。 7．由于时间的限制未能进一步进行表达条件和纯化条件的优化，获得大量高纯度的有活性的目的蛋白。因此，尚无法确定所得到的蛋白是否有抗肿瘤活性及其导向性的优劣。 结论： 利用基因工程技术对hTNF-α的结构进行了成功改造，初步探索了rhTNF-α在大肠杆菌系统表达的条件以及表达产物的提取纯化方法。为下一步获得有活性的rhTNF-α融合蛋白及其活性检测奠定基础，也为进一步研究开发新型高效低毒抗肿瘤药物提供新的思路和方法。本实验尚未获得大量高纯度的rhTNF-α融合蛋白，同时融合蛋白的表达和纯化方案也需要进一步改进和完善。 收起