摘要: 本文以番茄叶霉病菌为试验菌种，对壳聚糖的抑菌活性及其机制进行了研究。揭示了壳聚糖抑制番茄叶霉病菌的作用阶段，研究了不同因素对壳聚糖抑菌活性的影响，推测了不同分子量壳聚糖的抑菌机理；检测了壳聚糖诱导番茄产生对番茄叶霉病的抗性，并对其... 展开 本文以番茄叶霉病菌为试验菌种，对壳聚糖的抑菌活性及其机制进行了研究。揭示了壳聚糖抑制番茄叶霉病菌的作用阶段，研究了不同因素对壳聚糖抑菌活性的影响，推测了不同分子量壳聚糖的抑菌机理；检测了壳聚糖诱导番茄产生对番茄叶霉病的抗性，并对其机制进行了研究，为壳聚糖作为生物农药的开发利用奠定基础。测定了壳聚糖对番茄生长发育及其产量和品质的影响，为壳聚糖在番茄生产上的应用提供了科学依据。 一、壳聚糖样品的制备 用醋酸降解的方法制备了一系列不同分子量(38 KDa-1540 KDa)的壳聚糖样品，且这些样品的脱乙酰度均为80％左右；采用醋酸酐乙酰化法制得一系列不同脱乙酰度(73％-95％)的壳聚糖样品，其分子量均在1600 KDa左右；并用红外分光光度计(FT/IR-430)进行了红外图谱检测。 二、壳聚糖体外抑菌及其机理 用含毒介质法测定了分子量、脱乙酰度、溶剂、环境pH值及浓度对壳聚糖抑制番茄叶霉病菌活性的影响。结果表明，壳聚糖对番茄叶霉病菌的孢子萌发和菌丝体生长均具有明显抑制作用，对产孢量影响不显著。在研究范围内，随浓度的增加和环境pH值降低，抑菌活性增强；使壳聚糖具有较好抑菌效果的溶剂是乳酸和醋酸；脱乙酰度为86％、分子量为213 KDa-499 KDa的壳聚糖抑菌效果较好。室内药效试验证明：低浓度壳聚糖对番茄叶霉病菌的抑菌效果不及三唑酮、多菌灵等常用杀菌剂；但当浓度达到2 mg/ml时，它们的药效相当。 用光镜、电镜和激光共聚焦显微镜对不同分子量壳聚糖的抑菌机制进行了研究。光镜观察结果表明，浓度为0.5 mg/ml，分子量为82 KDa(CTS3)和1320 KDa(CTS7)的壳聚糖使菌丝体出现肿胀、分支增多、体细胞变短等形态学变化。扫描电镜观察，0.5 mg/ml的CTS3处理的菌丝体，肿胀但表面光滑，可能是壳聚糖进入了菌丝体内部；而CTS7处理的菌丝体，肿胀并且表面粗糙，壳聚糖凝聚在菌丝体周围，形成了一层高分子膜。用激光共聚焦显微镜进一步观察证明： 浓度为0.5 mg/ml、分子量小于499 KDa的壳聚糖能够进入番茄叶霉病菌体内；而分子量为1320 KDa的壳聚糖被阻挡在了菌丝体外面，从而推测不同分子量壳聚糖具有不同的抑茵机制。测定了壳聚糖对番茄叶霉病菌的渗透势和几丁质酶活的影响。结果表明，壳聚糖处理后，在90 min内菌丝体的相对渗透势增加最快，其几丁质酶活也有一定程度的提高，阐明了壳聚糖的抑菌机制与其增加菌丝体细胞膜的透性和几丁质酶活有关。 三、壳聚糖诱导番茄对番茄叶霉病的抗性及其机理 用不同分子量和不同浓度的壳聚糖对番茄进行抗性诱导后接种，可在一定程度上诱导番茄植株产生对番茄叶霉病的抗性。随壳聚糖浓度及其分子量的增加，诱导效果均呈现先增后减的趋势，5 mg/ml左右的浓度、分子量为213 KDa的壳聚糖诱导效果较好；叶面喷施的诱导效果优于浸种。叶面喷施浓度为5 mg/ml，分子量为213 KDa(CTS5)的壳聚糖诱导后，其相对防效达53.77％；而同浓度的CTS5浸种处理，相对防效为29.96％。 壳聚糖浸种和叶面喷施均能不同程度地诱导番茄叶片中过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶的活性增加，但不同分子量壳聚糖、在不同浓度下、采用不同的处理方式对各种酶的作用效果不同，不同酶的时序变化也存在差异。 ①，两种不同分子量的壳聚糖浸种处理，随其浓度的增加，POD、PPO及β-1，3-葡聚糖酶的变化规律基本一致，而PAL和几丁质酶的变化规律不同。对于POD，CTS3的诱导效果好于CTS7，而对于PPO、PAL、几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶，CTS7好于CTS3；CTS7在浓度分别为0.313、0.625、0.313、5、20 mg/ml时，POD、PPO、PAL、β-1，3-葡聚糖酶和几丁质酶达最大值；而CTS3在浓度为0.313 mg/ml时，POD、PPO、PAL和β-1，3-葡聚糖酶达最大值，1.25 mg/ml时，几丁质酶达最大值。 ②五种不同分子量的壳聚糖叶喷处理，CTS5对POD、PAL和β-1，3-葡聚糖酶的诱导效果较好，而分子量为3 KDa的壳聚糖(CTSl)和CTS3分别对PPO和几丁质酶的诱导效果较好。CTS5在浓度为6 mg/ml时，POD和PAL达最大值；3 mg/ml时，β-1，3-葡聚糖酶和几丁质酶达最大值；10 mg/ml，PPO达最大值。CTS5处理，POD、PPO、PAL、β-1，3-葡聚糖酶和几丁质酶分别在第5、2、3、1、2 d达最大值。③对于CTS3和CTS7两种壳聚糖，在5 mg/ml的浓度下，浸种处理时，CTS7比CTS3的诱导效果好；而叶喷处理，除PAL外，对其余四种酶的诱导效果，CTS3好于CTS7。叶喷处理比浸种处理对五种酶的诱导效果更好。 CTS5喷施次数对不同酶的影响不同：喷施一次PAL、几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶的活性增幅最大；喷施两次POD活性增幅最大：喷施三次PPO的活性增幅最大。 进一步的实验结果表明，喷施壳聚糖CTS5后，PPO及PAL属于系统获得性诱导，而POD、几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶属于局部获得性诱导。 用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)对不同处理的番茄叶片内总蛋白、POD和PPO同工酶进行了分析。电泳图谱显示，总蛋白主要表现在区带数目和着色深浅的不同：在壳聚糖叶喷次数对总蛋白的影响试验中，叶喷一、二次的处理，分别关闭或加强了某些基因的表达；叶喷三次的处理，只是加强了某些基因的表达。在不同分子量壳聚糖对总蛋白的影响中，CTSl的处理少两条带，CTS3、CTS7、CTS8少一条带，说明他们关闭了某些基因的表达；CTS5与对照数目相当，着色略深，说明CTS5只是加强了某些蛋白的表达。不同壳聚糖浓度对总蛋白的影响中，6mg/mlCTS5处理的谱带着色最深，说明该浓度CTS5最能加强某些蛋白的表达。而POD和PPO同工酶谱带主要是着色深浅的区别，其主带强弱变化基本与相应的酶活性一致，但没有发现新酶带的增加。 叶喷壳聚糖对番茄叶片活性氧影响的试验结果表明，叶面喷施壳聚糖4 h后，出现活性氧爆发的现象；16 h后，又出现抑制氧自由基产生的现象，推测壳聚糖对番茄的诱导抗性与活性氧的变化有一定关系。 药效试验结果显示，壳聚糖与三唑酮混施，对番茄叶霉病的防治效果明显优于生产上通常使用的多菌灵和三唑酮。10 mg/ml壳聚糖与500倍三唑酮的防效相当。 四、壳聚糖对番茄生长发育的影响 以番茄(合作908)为试材，研究了壳聚糖对番茄种子萌发、生长发育、产量及品质等的影响。结果表明：一定浓度的壳聚糖能够明显促进种子萌发、提高番茄幼苗质量和促进其生长发育，具有一定的增产效果，并能够不同程度的改善番茄果实中可溶性固形物、Vc含量、总蛋白含量和总酸度，改善果实营养品质与风味；并且，不同分子量壳聚糖的作用效果不同。①适宜浓度壳聚糖能促进番茄种子萌发。大田发芽试验，大分子量的CTS7和小分子量的CTS3分别在1.25 mg/ml和2.5 mg/ml浓度下，发芽率、发芽指数和活力指数三项指标均达最大值。而室内发芽试验，CTS7和CTS3分别在0.625mg/ml和1.25 mg/ml的浓度下，三项指标达最大值；在室内试验中，大分子量的CTS7效果最差，中间分子量CTS3和CTS5效果最好。大田发芽试验比室内试验成苗率明显高。②壳聚糖对番茄幼苗的株高和鲜重影响显著，但对根长和根鲜重影响达不到显著水平的差异。浸种处理，CTS7在0.625～2.5 mg/ml之间对番茄生长的促进效果较为明显，在2.5 mg/ml达到最大值；CTS3在1.25～5mg/ml之间对番茄生长的促进效果较为明显，在5 mg/ml达到最大值。叶喷处理，CTS7浓度为1.25 mg/ml时对番茄生长的促进效果最明显，CTS3在2.5 mg/ml时对番茄生长的促进效果最明显。③1.25 mg/ml浓度的CTS5对番茄增产效果最显著，并使番茄中可溶性固形物、Vc含量及总蛋白含量增加，总酸度降低。④壳聚糖还对番茄生产中的根结线虫具有一定的防治效果。 收起