摘要: 蚯蚓(Earthworm)在中医药中对感染性疾病的药学、临床学的医治效果以及对蚯蚓组织提取物抗病毒作用研究的结果均提示，蚯蚓组织中存在着由多种因子组成的、能够抑制、降解微生物和单细胞生物的分子系统，各分子相互协同，完成蚯蚓以微生物为食的消化、... 展开 蚯蚓(Earthworm)在中医药中对感染性疾病的药学、临床学的医治效果以及对蚯蚓组织提取物抗病毒作用研究的结果均提示，蚯蚓组织中存在着由多种因子组成的、能够抑制、降解微生物和单细胞生物的分子系统，各分子相互协同，完成蚯蚓以微生物为食的消化、吸收功能。核酸酶类是这一分子体系中的一类必须的组成元件，其作用不仅与其消化作用有关，还是一种通过降解遗传物质，杀灭微生物的有效机制。 国内外对核酸酶的生物学意义研究甚少，结论也不甚明确，目前尚未见核酸酶与免疫及固有免疫、抗病毒等的系列研究报道。值得注意的是，以往的研究中证实了核酸酶在已发现的各种动物消化道中大量存在的事实，但均习惯性地认为与核酸的消化吸收有关。这一观点与体内的核苷酸代谢和核酸代谢相矛盾。因为在绝大多数的动物体内，核苷酸的合成原料并不依赖消化道的吸收来提供，而是以氨基酸及其代谢产物为主要原料的“从头合成”和“补救合成”途径来满足机体的需要。营养学的研究也不支持这种观点，因为核苷酸及其代谢产物均不是人体的必需营养素。那么消化道中种类如此齐全、活性很强的核酸酶应该还有其他重要的生物学意义，比如清除食物中的核酸、防止外源基因侵入、拟或杀灭病毒和微生物。原核生物中的限制性酶体系支持这种假设，它的基因“免疫”系统在保证遗传稳定性方面有着重要价值。 近年来对核酸酶与免疫系统的关系进行了初步研究，结果表明，核酸酶在各种免疫细胞中有着广泛的分布和极高的活性，提示其与固有免疫有着密切的关系。为了进一步证实蚯蚓组织中核酸酶的种类、数量、酶学性质、结构以及生物学功能及其作用机制，探索核酸酶在以微生物为食的多种生物中存在的普遍性、该酶类与免疫系统降解内、外源废弃细胞和微生物机制的关系，本文选择蚯蚓作为研究模型，分四部分对蚯蚓组织中多种核酸酶进行了分离纯化、理化性质和酶学性质研究，初步探索多种低等生物和免疫细胞中核酸酶的活性、数量和分布。各部分研究结果分别简述如下： 一、蚯蚓组织核酸酶(EWDs和EWNs)的分离、纯化 采用酶学、蛋白质研究技术和核酸酶分析技术，首先对蚯蚓组织核酸酶粗提液与提取、纯化相关的理化、酶学性质进行了研究，并用常压、高效色谱系统研究了蚯蚓组织中具有核酸酶活性的各组分的层析行为和条件，确定了本文中酸性条件、有机溶剂和等电点沉淀的提取方案和阴离子、阳离子交换串联层析结合PAGE电泳的高效、经济的纯化技术路线，并用多种核酸酶活性分析技术对以上各酶进行了活性确定。结果表明，蚯蚓组织中存在3种DNA酶，分别命名为EWD<,1>(157kDa)、EWD<,2>(69.1kDa)、 EWD<,3>(62.6kDa)，纯度为电泳纯： 5种核酸酶EWNl(EarthWorm Nuclease 1)、EWN<,2>(Earthworm Nuclease 2)、EWN<,3>(EarthwormNuclease 3)、EWN4(Earthworm Nuclease 4)、EWN<,5>(Earthworm Nuclease 5)，纯度为层析纯。以上发现尚未见报道。该研究为证明蚯蚓组织中核酸酶多样性提供了可靠的实验证据，并为进一步的酶学、结构、功能等研究提供了高纯度的样品，奠定了基础。 二、蚯蚓组织中核酸酶(EWDs和EWNs)酶动力学、性质和影响酶活性因素的研究 本部分研究采用Sephacryl-200柱层析、SDS-PAGE电泳、MALDI-TOF三种方法确定了EWD<,1>、EWD<,2>、EWD<,3>的分子量分别为157kDa、69.1kDa、62.6kDa。明显大于已发现的DNase Ⅰ和DNaseⅡ。对EWDs和EWNs进行了温度稳定性、pH稳定性、激动剂、抑制剂研究，给出了各影响因素的参数，这些参数与已发现的各种DNases相比较有明显差别。但三种EWDs的酶学性质极为相似，理化性质稳定。酶动力学研究表明，三种EWDs的Km值分别为1.58、3.95和1.52mg/ml，表明EWD<,2>活性>EWD<,3>>EWD<,3>。EWNs具有RNA酶活性，其活性不依赖于Mg<'2+>、Ca<'2+>、Mn<'2+>等。以上结果提示，蚯蚓组织中已发现的核酸酶EWDs、EWNs具有特殊的酶学特征。其作用机理和分类有待于进一步的研究和归类。 三、蚯蚓组织核酸酶(EWDs和EWNs)作用机制的研究 本部分采用ZORBAX-Oligo柱-HPLC、琼脂糖电泳、紫外分光光度法等分析技术，进行了EWDs、EWNs对环状、线状DNA、单链DNA的降解中间产物和终产物的观察和分析。结果表明，EWDs、EWNs对所有的形式的DNA底物均有降解作用，降解产物为较均一的、<18bp的寡核苷酸，各酶的降解终产物无明显长度差异。EWNs同时还具有降解RNA底物的作用，EWDs无此作用。结果提示，EWDs为脱氧核糖核酸内切酶类(DNases)，EWNs为非特异性核酸酶(Nucleases)。 四、双胸蚓组织中核酸酶的生物学作用及其机制的研究 用琼脂糖电泳DNA酶活性测定法研究了与蚯蚓生活习性相近的几种低等生物组织提取液中核酸酶的活性分布；同时研究了几种主要的免疫细胞中DNA酶的活性分布情况，结果表明，红线虫、水蚤、黄粉虫等低等生物的组织提取液中，含有高活性的DNA酶。研究的几种免疫细胞中，包括白细胞、淋巴细胞、巨噬细胞中均存在大量的、高活性的核酸酶。 结论： 1.建立了分离、纯化蚯蚓组织核酸酶的技术路线，并分离出3种DNA酶，分别名为EWD<,1>(157kDa)、EWD<,2>(69.1kDa)、EWD<,3>(62.6kDa)，纯度为电泳纯； 5种核酸酶EWNl(Earthworm Nuclease 1)、EWN2(Earthworm Nuclease 2)、EWN<,3> (Earthworm Nuclease 3)、 EWN<,4> (Earthworm Nuclease 4)、 EWN<,5>(Earthworm Nuclease 5)，纯度为层析纯； 2.对蚯蚓组织中核酸酶(EWDs和EWNs)酶动力学性质和影响酶活性因素进行了研究，结果表明，蚯蚓组织纯化的三种DNA酶(EWD<,1>、EWD<,2>、EWD<,3>)的分子量分别为157 kDa、69.1 kDa和62.6 kDa，作用底物是DNA，包括双链DNA、单链DNA、环状DNA和线状DNA，最适pH值在4.0～5.6之间，对温度较为敏感，55℃时，失去DNA酶活性，Mn<'2+>、Ca<'2+>为其活性抑制剂，Mg<'2+>对酶的活性无明显影响； 3.首次用采用ZORBAX-Oligo柱-HPLC等分析技术对EWDs、EWNs的底物特异性和降解行为进行了研究，结果表明，EWDs、EWNs对所有的形式的DNA底物均有降解作用，降解产物为较均一的、<18bp的寡核苷酸、各酶的降解终产物无明显长度差异。EWNs同时还具有降解RNA底物的作用，EWDs无此作用。结果提示，EWDs为脱氧核糖核酸内切酶类(DNases)，EWNs为非特异性核酸酶(Nucleases)。 4.线虫、水蚤、黄粉虫等低等生物的组织提取液中，含有高活性的DNA酶。研究的几种免疫细胞中，包括白细胞、淋巴细胞、巨噬细胞均存在大量的、高活性的核酸酶。 收起