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国家工程技术图书馆
2022年11月29日
摘要: 背景与目的:基因组印记(Genomic Imprinting)是指由于表遗传学水平的修饰特意地沉默某一亲代来源的等位基因,具有这种特征的基因称为印记基因。人胰岛素样生长因子2(Insulin-like growth factor 2, IGF2)和H19即为研究较早的一对相互毗邻的印记... 展开 背景与目的:基因组印记(Genomic Imprinting)是指由于表遗传学水平的修饰特意地沉默某一亲代来源的等位基因,具有这种特征的基因称为印记基因。人胰岛素样生长因子2(Insulin-like growth factor 2, IGF2)和H19即为研究较早的一对相互毗邻的印记基因。IGF2编码的胰岛素样生长因子-2是一种胚胎生长因子及细胞有丝分裂原,在人体内大多数组织中特异地表达父系来源的等位基因,而母源等位基因处于印记状态。H19表达一种功能尚不清楚的RNA,其印记状态与IGF2相反,目前发现H19在正常组织内均为母源等位基因表达,父源等位基因印记。印记基因表达异常包括印记丢失(Loss of imprinting, LOI)和印记获得(Gain of imprinting, GOI),近年来大量的研究表明,印记异常是某些恶性肿瘤重要的分子生物学特征,这种表遗传学改变可能是癌变机制中的重要环节。几乎所有的印记基因中都有一些区域在两个不同亲本来源的等位基因中仅有一方是甲基化,这些序列被称为“差异甲基化区域”(Differentially methylated regions, DMRs)或“印记控制区”(Imprinting control region, ICR)。针对小鼠的一系列删失实验证明,H19上游的ICR可调控IGF2和H19的印记状态;在人结肠癌、骨肉瘤等恶性肿瘤中也发现H19上游DMR(H19DMR)的甲基化状态与IGF2和/或H19的印记异常有关。 原发性肝癌是严重威胁人类健康的重要疾病之一,其发病率和死亡率均很高,尤其在亚洲和南非地区,但目前关于人肝癌中的印记状态及调控机制的研究报道尚不多见。本课题拟通过同时检测人原发性肝癌中IGF2和H19的印记改变及H19DMR的甲基化状态,研究这三者与肝癌的关系;同时分析三者之间的相互关系,探讨肝癌中H19DMR在IGF2/H19印记调控中的作用,从而为揭示IGF2和H19基因的印记调控机制积累更名的资料。 材料与方法:收集36例原发性肝癌患者手术切除的肝癌组织和5例细胞株标本(肝癌细胞株Bel-7402、SMMC-7721、HepG2、Huh-7,胚肝细胞株L-02),以7例健康人肝组织作为正常对照。利用IGF2第九外显子内有一单核苷酸多态位点与ApaⅠ酶切位点重叠和H19第五外显子内有一单核苷酸多态位点与RsaⅠ酶切位点重叠的特性,采用PCR-RFLP方法分析各个标本的基因型,对IGF2或H19多态位点杂合的标本,用RT-PCR-RFLP方法分析其印记状态;同时用测序方法筛选H19DMR内3个单核苷酸多态位点杂和的标本,并将其基因组DNA用亚硫酸氢钠/氢醌修饰后扩增出包含上述3个多态位点的H19DMR片断,连入T-载体,克隆并测序,根据胞嘧啶是否被转换为胸腺嘧啶分析各标本中每条等位基因的甲基化状态。 结果:48例待测标本中,共筛出25例(7例正常肝,17例肝癌,1例细胞株)IGF2杂合标本,14例(3例正常肝,11例肝癌)H19杂合标本,25例(5例正常肝,20例肝癌)H19DMR杂合标本。正常人肝组织中,IGF2呈双等位基因表达,H19呈单等位基因表达,H19DMR呈等位基因特异的差异甲基化状态。多态位点杂合的肝癌组织标本中,47.1%(8/17)检测到IGF2的印记获得,45.5%(5/11)检测到H19的印记丢失,IGF2和H19的印记之间没有明显的相关性(P>0.05)。50.0%(10/20)的H19DMR杂合肝癌标本中检测到一种或多种H19DMR状态异常,而且与IGF2/H19印记改变密切相关(P<0.05)。其中20.0%(4/20)检测到H19DMR等位基因特异的低甲基化改变,但与IGF2的印记获得无关(P>0.05),对H19的印记丢失也不是必要条件;35%(7/20)的肝癌标本中发现了H19DMR区域两条等位基因数量失衡现象,而且H19DMR甲基化等位基因的减少或非甲基化等位基因的增加与IGF2 GOI相伴随,而H19DMR非甲基化等位基因的减少或甲基化等位基因的增加与H19 LOI相伴随。 结论:正常成人肝组织中IGF2为双等位基因表达,H19为单等位基因表达,H19DMR保持了差异甲基化状态;IGF2的印记获得与H19的印记丢失是人原发性肝癌中的频发事件,但在肝癌中IGF2与H19的等位基因表达呈相对独立性;人原发性肝癌中H19DMR等位基因特异的异常低甲基化比其异常高甲基化更常见;人原发性肝癌中H19DMR的异常甲基化状态与IGF2和H19的印记改变密切相关,但不是充分条件,提示在人原发性肝癌中,除了H19DMR第六CTCF结合位点附近区域甲基化状态的改变,可能尚有其他区域或机制参与调控IGF2/H19的印记状态。 收起
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