摘要 : 目的探讨不同浓度的二甲双胍对体外培养的多房棘球蚴囊泡及原头节自噬及凋亡的影响。方法将体外培养的多房棘球蚴囊泡及原头节与1、 5、 10 mmol/L的二甲双胍分别共培养24、 48 h,以PBS为对照,显微镜下观察囊泡的活性、大小及透明度,使用伊红染色观察... 展开 目的探讨不同浓度的二甲双胍对体外培养的多房棘球蚴囊泡及原头节自噬及凋亡的影响。方法将体外培养的多房棘球蚴囊泡及原头节与1、 5、 10 mmol/L的二甲双胍分别共培养24、 48 h,以PBS为对照,显微镜下观察囊泡的活性、大小及透明度,使用伊红染色观察原头节的活性,并计算成活率;1、 5、 10 mmol/L的二甲双胍与多房棘球蚴原头节共培养48 h时,利用试剂盒测定原头节中与细胞凋亡相关的半胱氨酸肽酶3(caspase3)、 caspase9酶活性;收集囊泡中的生发层细胞,使用流式细胞术检测其凋亡情况;提取囊泡及原头节蛋白,使用蛋白质免疫印迹(Western blotting)分析与细胞凋亡相关的剪切-caspase3 (cleaved-caspase3)、 caspase9、B淋巴细胞瘤(Bcl-2)的相对表达量;1、 5、 10 mmol/L的二甲双胍与多房棘球蚴囊泡及原头节共培养48 h时,Western blotting分析二甲双胍对囊泡及原头节中磷酸化一磷酸腺苷(AMP)依赖的蛋白激酶(P-AMPK)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR),自噬相关基因14 (Atg14)、自噬相关蛋白LC3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)的变化。两组间差异的比较采用t检验,多组间差异的比较采用方差分析。结果 1、 5、 10 mmol/L的二甲双胍与多房棘球蚴囊泡共培养后,随着培养时间的延长囊泡活性逐渐下降,囊泡内结构紊乱,浑浊度增加;与10 mmol/L二甲双胍共培养48 h时,可见囊泡中形成类似于凋亡小体样结构。不同浓度二甲双胍与多房棘球蚴原头节共培养24 h时,1、 5、10 mmol/L组原头节存活率分别为(0.91±0.10)%、(0.8±0.12)%、(0.57±0.11)%,低于对照组(0.99±0.02)%(F=95.829,P <0.05);共培养48 h后,1、 5、 10 mmol/L原头节存活率分别为(0.68±0.18)%、(0.46±0.15)%、(0.04±0.01)%,低于对照组(0.80±0.22)%(F=287.524,P <0.05)。与10 mmol/L二甲双胍共培养至48 h时,所有原头节均出现红染;共培养48 h时,1、 5、 10 mmol/L组中原头节caspase3相对表达量分别为33.32±2.94、 53.89±1.01、 124.88±26.44,高于对照组(16.21±6.20)(F=36.628.452,P <0.05);caspase9相对表达量分别为47.48±9.56、 54.50±1.29、 165.09±16.85,高于对照组(25.295±3.560)(F=120.612,P <0.05)。共培养48 h后,1、 5、 10 mmol/L组囊泡生发层细胞的凋亡率分别为(14.94±1.35)%、(23.85±2.97)%、(33.87±4.93)%,高于对照组(8.92±1.95)%(F=293.45,P <0.05),1、 5、 10 mmol/L组cleaved-caspase3、 caspase9的相对表达量均高于对照组(F=144.574、 45.675,P <0.05),Bcl-2的相对表达量低于对照组(F=16.642,P <0.05)。不同浓度二甲双胍与原头节共培养48 h后,1、 5、 10 mmol/L组中cleavedcaspase3、 caspase9的相对表达量均高于对照组(F=36.044、 19.950,P <0.05);Bcl-2的相对表达量均低于对照组(F=39.487,P <0.05)。不同浓度二甲双胍与囊泡共培养48 h后,1、 5、 10 mmol/L组P-AMPK、 mTOR的相对表达量均高于对照组(F=33.342、 60.617,P <0.05),自噬相关蛋白Atg14、 LC3-Ⅱ的相对表达量均低于对照组(F=41.688、 41.375,P <0.05)。不同浓度二甲双胍与原头节共培养48 h后,P-AMPK、 mTOR、 Atg14、LC3-Ⅱ的相对表达量均高于对照组(F=25.853、 10.695、 12.528、 17.613,P <0.05)。结论二甲双胍在体外可抑制多房棘球蚴囊泡及原头节的活性并促进其凋亡,呈现浓度依赖性及时间依赖性,通过AMPK-mTOR信号通路启动自噬以发挥作用。 收起