中国科学技术信息研究所--国家工程技术数字图书馆

[学位论文] 吴青树浙江大学 2016年硕士导师: 黄磊共89页

摘要 : 谷胱甘肽是一种含有巯基的小分子肽类物质，具有抗氧化、抗病毒、增强机体免疫力等多种生理功能，在医药、化妆品和食品行业有着广泛的应用。本文以提高体外多酶催化合成谷胱甘肽效率为目标，将锚定区域(Dockerin domain)引入谷胱甘肽双功能酶GshF，实... 展开谷胱甘肽是一种含有巯基的小分子肽类物质，具有抗氧化、抗病毒、增强机体免疫力等多种生理功能，在医药、化妆品和食品行业有着广泛的应用。本文以提高体外多酶催化合成谷胱甘肽效率为目标，将锚定区域(Dockerin domain)引入谷胱甘肽双功能酶GshF，实现ATP再生的ADK酶和PAP酶，在大肠杆菌中重组表达，经亲和层析纯化后与蛋白支架进行组装，用于催化合成谷胱甘肽。克隆获得锚定区域基因和谷胱甘肽双功能酶GshF、ADK和PAP基因，通过酶切连接后整合到pET-28a(+)载体，构建重组表达载体pET28a(+)-GshF-Doc1-1,pET28a(+)-PAP-Doc1-3,pET28a(+)-ADK-DocⅡ。另外，从嗜纤维梭菌基因组DNA PCR扩增获得将含有对应粘连区域(cohesin)的Coh1-1、CohⅡ和CBD-Coh1-3基因，连接到pET-Duet1载体，构建重组表达载体pETDuet-1-Coh1-1-CohⅡ-CBD-Coh1-3。以E.coli BL21(DE3)作为表达宿主，优化重组蛋白GshF-Doc1-1的表达条件。结果表明:培养宿主菌至其对数生长中期，培养温度设置为28℃，加入最终浓度为0.2mmol/L的IPTG诱导， GshF-Doc1-1的最高酶活力可达2332U/L。对重组表达蛋白进行Ni-NTA亲和层析纯化，纯化后GshF-Doc1-1的比酶活达13.24U/mg，是粗酶的13.4倍，酶活收率达到76％。开展了GshF-Doc1-1酶学特性研究，GshF-Doc1-1催化反应的最适温度为37℃，最适pH为8.5，催化反应最适的ATP和Mg2+浓度分别为10mmol/L和30mmol/L，过量的ATP对酶催化反应有一定的抑制作用。重组菌E.coli BL21(DE3)/ pET28a(+)-ADK-DocⅡ经IPTG诱导表达的产物，利用Ni柱亲和层析纯化，纯化后的ADK-DocⅡ比酶活达2.8U/mg。利用ADK-DocⅡ催化ADP生成ATP，反应平衡后ATP∶ADP=1∶1.32，ADP的转化率达到42.4％，反应最佳pH为8.0，最适温度为40℃。重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-PAP-Doc1-3经IPTG诱导表达的产物，利用Ni柱亲和层析纯化，纯化后的PAP-Doc1-3比酶活达2.3U/mg。利用PAP-Doc1-3催化AMP生成ADP，反应平衡后AMP∶ADP=1∶1.52，ADP的转化率达到70.2％。反应最佳pH为8.5，最适温度为50℃。最后，将GshF-Doc1-1、ADK-DocⅡ、 PAP-Doc1-3固定在蛋白支架上，用于催化合成谷胱甘肽，在加入终浓度为5mmol/L ATP和5mmol/L polyP条件下，经过3小时的反应，GSH的最终产量可达5.6mmol/L，比未采用蛋白支架组装多酶合成谷胱甘肽的产量提高了25％左右。此过程中相当于消耗了11.2mmol/LATP，表明ATP再生效率约为2。多酶催化体系反应的最适反应温度为37℃，最适pH为7.5。收起

关键词 : 谷胱甘肽制备工艺谷胱甘肽双功能酶基因克隆蛋白支架

2. ABC转运蛋白基因（ABC）和谷胱甘肽蛋白基因（GRX）在陆地棉盐胁迫响应中的交互作用机制

[学位论文] Waqar Afzal Malik 中国农业科学院 2021年博士导师: 叶武威共237页

摘要 : 对非生物胁迫的感知和信号转导激活植物的适应反应对植物在多变环境下的生存和生长具有重要意义。逆境下，氧化胁迫的产生，表明活性氧(ROS)对生物系统的损害与生物系统随时解除ROS毒害或修复由ROS造成的损伤之间存在不平衡状态。植物对干旱、盐碱、热... 展开对非生物胁迫的感知和信号转导激活植物的适应反应对植物在多变环境下的生存和生长具有重要意义。逆境下，氧化胁迫的产生，表明活性氧(ROS)对生物系统的损害与生物系统随时解除ROS毒害或修复由ROS造成的损伤之间存在不平衡状态。植物对干旱、盐碱、热、冷、紫外线和重金属胁迫等环境变化具有多种适应机制，包括激素平衡的调节、应激蛋白的合成、抗氧化防御机制的激活、代谢产物的积累和细胞膜的重排。耐盐性是一个复杂的性状，涉及许多基因家族的协同作用，这些基因家族具有气孔水分流失、离子区隔化、代谢调节、渗透调节和抗氧化防御等多种功能。近年来，分子生物学、基因组学、蛋白质组学和代谢组学的研究进展为植物基因调控网络系统的研究提供了新的思路。植物基因调控网络系统主要由诱导基因(环境因子和发育因子)、表达编程和调控元件(顺式元件和反式元件)、相应的生化途径和多种信号因子。谷胱甘肽氧化酶(Glutaredoxins，GRXs)是一种普遍存在的氧化还原酶，参与多种细胞过程，在氧化应激反应机制中发挥关键作用。ATP结合簇转运体构成了一个无处不在的膜蛋白超家族，负责ATP驱动的配体跨生物膜易位，这个过程对细胞生理学的正常维持起着至关重要的作用。GRXs可以与ABC转运体相互作用，使各种底物跨浓度梯度发生易位。本研究旨在探讨ABC转运体和GRX基因应对各种非生物胁迫时的结构.功能关系，并为功能验证和生化鉴定提供理论基础。此外，我们的研究还包括对盐胁迫相关的重要基因家族的全基因组调查和调控网络分析，以深入了解它们的结构、功能和进化关联。更重要的是，盐胁迫应答核心转录组分析的共表达网络、蛋白-蛋白相互作用网络和高通量蛋白建模与对接揭示了GRX和ABC基因家族的强相互作用。其中，GhABCG9与GhGRXC9基因间存在显著的交互作用，为功能基因组学研究提供了新的方向。我们研究发现，陆地棉中存在127个编码GRX蛋白的基因。系统发育分析表明，来自2个典型单子叶植物和9个双子叶植物的758个GRX基因可分为4类。通过对棉花、水稻和拟南芥保守蛋白基序的组织和序列标识的比较，这种分类结果也得到了确认。棉花GRX基因家族经历了较强的净化选择，但功能差异有限。四种棉属植物的共时性分析显示出良好的共线性关系。在表达分析中，发现大部分棉花GRX基因的表达受到不同植物激素和非生物胁迫的影响，这表明GRX蛋白在应对氧化胁迫过程中发挥着重要作用。顺式调控元件、基因富集和共表达网络分析，GhGRXC9基因在拟南芥中的过表达分析，在棉花中的VIGS分析，在烟草中的亚细胞定位以及在拟南芥中GUS启动子的活性分析，也表明了GRXs基因耐多种非生物胁迫的作用。全基因组和片段复制是GhGRX基因家族在进化过程中扩增的两个主要动力。在特定组织或环境胁迫反应中差异表达GRX基因的鉴定，为深入研究候选重要基因提供了新的途径。基于拓扑结构域、基因定位、蛋白大小、蛋白相似度和进化关系分析，陆地棉ABC转运蛋白基因家族的全基因组鉴定结果发现，320个ABC转运蛋白可分为四组(含全部结构域、含一半结构域、含四分之一结构域和只含ABC2结构域)，八个家族(ABCA到ABCG、ABCI)和12亚家族(MDR，PDR，MRP，PMP，AOH，ATH，ATM，TAP，WBC，RLI，GCN和NAP)。每个亚家族的ABC转运体结构动力学分析揭示这些基因在ATP结合和水解驱动底物易位耦合过程中的动力学和分子机制，展示了一种“结构-功能关系”。蛋白质基序和基因组组织的分析显示，在同一亚家族中存在结构和功能上的保守，但在不同亚家族中存在差异。单个小ABC基因的大量存在暗示更高的基因丢失率/产生率及功能和环境适应性的持续进化。通过对全基因组重复的研究，发现了片段重复和串联重复在棉花ABC基因家族扩增中的作用。总Ka/Ks比值表明4个棉花品种在进化过程中对ABC基因有强烈的纯化选择。此外，基因组织特异性表达谱和基于RNA-Seq数据的GhABCs共表达网络表明它们参与了多种分子、细胞和生物学过程。预测的顺式元件和基因富集结果也表明它们在底物易位、异生物解毒、抗病、极性生长素运输、脂质代谢、激素反应和非生物胁迫中的起作用。正向和反向遗传以及异源表达已经揭示了植物ABC蛋白的许多新作用。对环境刺激反应中表达差异的ABC基因的鉴定和蛋白质建模的结构进展将为未来的研究提供清晰和定性的分子基础。本研究将进一步拓展我们对棉花ABC基因家族的进化和功能的理解和认识。收起

关键词 : 陆地棉盐胁迫响应 ABC转运蛋白基因谷胱甘肽蛋白基因

3. 拟南芥GRXS12调控盐胁迫抗性分子机理研究

[学位论文] 张瑞山东农业大学 2023年硕士导师: 黄金光共83页

摘要 : 土壤盐渍化严重影响植物的生长发育和作物产量。世界范围内约33％的农田受到土壤盐渍化影响，因此提高植物盐胁迫抗性并有效开发利用盐渍化土地具有重要意义。在长期进化过程中，植物产生了一系列抵御盐胁迫的生理生化机制，包括氧化还原平衡、离子稳... 展开土壤盐渍化严重影响植物的生长发育和作物产量。世界范围内约33％的农田受到土壤盐渍化影响，因此提高植物盐胁迫抗性并有效开发利用盐渍化土地具有重要意义。在长期进化过程中，植物产生了一系列抵御盐胁迫的生理生化机制，包括氧化还原平衡、离子稳态调控、渗透调节物质合成等。谷氧还蛋白(Glutaredoxin,GRX)是硫氧还蛋白(Thioredoxin,TRX)家族的一类小分子氧化还原酶，其通过去谷胱甘肽化还原底物蛋白，也可作为Fe-S簇支架蛋白参与铁代谢，在植物胁迫响应和生长发育过程中发挥重要作用。拟南芥GRXS12通过单硫醇机制在氧化还原应激和去谷胱甘肽化中发挥重要作用，但其在应答盐胁迫中的功能与作用机制等重要科学问题仍不清楚。本研究以拟南芥GRXS12为研究对象，利用生物化学及分子生物学等技术与方法，探究了GRXS12调控盐胁迫与植物生长发育的功能及作用机理，为植物应答盐胁迫机制提供了新的见解。主要研究结果如下: (1)GRXS12正调控拟南芥盐胁迫抗性，且与离子胁迫和渗透胁迫抗性密切相关。通过主根长度、存活率、鲜重等生理指标发现，拟南芥grxs12在幼苗期及成苗期均表现出盐超敏感表型，过量表达GRXS12增强了转基因拟南芥的盐胁迫抗性。 (2)GRXS12定位于叶绿体，且其亚细胞定位不受盐胁迫影响。组织及诱导表达模式表明，GRXS12在莲座叶和花序中表达量较高，受盐、渗透胁迫、ABA等诱导表达。 (3)DAB、NBT染色结果显示，GRXS12调控拟南芥根尖中ROS水平。 (4)盐胁迫下grxs12根系积累更多的Na+,而K+含量显著降低，导致Na+/K+升高。 (5)与野生型相比，grxs12的花器官和种子明显增大，莲座叶生长缓慢，抽薹时间延迟，部分花粉失活且种子产量低，表明GRXS12调控拟南芥花、种子等器官的发育。 (6)GRXS12与MSRB1(methioninesulfoxidereductaseB1)互作，且将其去谷胱甘肽化。 (7)MSRB1正调控拟南芥盐胁迫抗性。综上所述，GRXS12参与调控拟南芥生长发育和盐胁迫抗性。收起

关键词 : 植物生长盐胁迫谷氧还蛋白 GRXS12基因谷胱甘肽化

4. 谷胱甘肽双功能合成酶的克隆表达、酶学性质及其应用的研究

[学位论文] 陈斌斌浙江大学 2015年硕士导师: 徐志南共76页

摘要 : 谷胱甘肽(L-Glutathione)是细胞内含量最多的非蛋白类巯基化合物，由谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸缩合形成的具有生物活性的三肽。在医药、食品和化妆品等行业有着广泛的应用。目前谷胱甘肽的的工业生产主要是通过酵母等微生物发酵，本文的主要研究内容是... 展开谷胱甘肽(L-Glutathione)是细胞内含量最多的非蛋白类巯基化合物，由谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸缩合形成的具有生物活性的三肽。在医药、食品和化妆品等行业有着广泛的应用。目前谷胱甘肽的的工业生产主要是通过酵母等微生物发酵，本文的主要研究内容是克隆表达来源Listeria monocytogenes的谷胱甘肽双功能合成酶GshF，进行酶学性质的研究，并克隆表达来源E.coli K-12的多聚磷酸激酶PPK，用于酶催化合成ATP，利用谷胱甘肽双功能酶和多聚磷酸激酶进行酶催化合成谷胱甘肽。首先，设计引物克隆获得Listeria monocytogenes的谷胱甘肽双功能酶基因，连接到pET28a(+)载体，构建重组表达载体pET28a(+)-gshF，以E.coli BL21(DE3)作为表达宿主，对其诱导表达重组蛋白的条件进行了优化，确定了表达重组蛋白的最优条件:在对数生长中期，调整培养温度到28℃后加入终浓度为0.2 mmol/L的IPTG进行诱导，摇瓶中GshF的最高酶活力可达2318 U/L。利用重组表达蛋白带有的His标签，对其进行Ni-NTA亲和层析纯化，纯化后的GshF的比酶活达14.68 U/mg，是粗酶的15.1倍，酶活回收率76％。并研究GshF的酶学特性:GshF催化反应的最适温度为37℃，最适pH为8.5，催化最适的ATP和Mg2+浓度为10 mmol/L和30 mmol/L，过量ATP对酶活反而有抑制作用。在37℃条件下，该酶的半衰期约为3h。最后用该酶进行体外催化合成GSH，GSH终产量为2.58 g/L。以甘油为碳源，对大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a(+)-gshF进行扩大培养，采用补料-分批发酵的方法，最终发酵OD600达86，外源蛋白GshF表达量达5.6 g/L。设计引物克隆来自大肠杆菌的多聚磷酸激酶基因ppk，成功构建了重组大肠杆菌表达体系BL21(DE3)/pET28a(+)-ppk，对其进行IPTG诱导表达，表达产物经Ni-NTA亲和层析纯化，纯化后的PPK比酶活达2.6 U/mg，酶活回收率41％，利用PPK催化ADP生成ATP，反应平衡时ATP∶ADP=1∶0.77，ADP的转化率达到42％。以PPK为基础的ATP再生体系与谷胱甘肽合成酶GshF一起用于酶催化谷胱甘肽，在初始5 mmol/L的ADP和5 mmol/L polyP下，经过3小时的反应，GSH最终产量为4.5 mmol/L(1.38 g/L)。收起

关键词 : 谷胱甘肽双功能合成酶基因克隆蛋白表达酶学性质

5. 水稻Phi GST蛋白质功能研究

[学位论文] 刘妍婧北京林业大学 2010年硕士导师: 陆海共58页

摘要 : 谷胱甘肽转移酶(GSTs,EC 2.5.1.18)是由一个庞大的基因家族编码。在植物中,根据其基因结构、序列保守性以及底物专一性等特点,可将GST家族分为Phi、Tau、Theta、Zeta、DHAR和Lambda等类型,其中Phi、Tau、DHAR和Lambda是植物所特有。本文以栽培水稻(Or... 展开谷胱甘肽转移酶(GSTs,EC 2.5.1.18)是由一个庞大的基因家族编码。在植物中,根据其基因结构、序列保守性以及底物专一性等特点,可将GST家族分为Phi、Tau、Theta、Zeta、DHAR和Lambda等类型,其中Phi、Tau、DHAR和Lambda是植物所特有。本文以栽培水稻(Oryza sativa)为研究材料,对水稻Phi GST基因进行了基因结构、基因表达模式及蛋白质功能研究,其主要结果如下: 1.从水稻基因组中鉴定出17个全长Phi GST基因,这些基因分布在4条染色体上,其中有12个Phi GST基因在水稻第1和第3条染色体上,形成2个基因簇,其余5个GST基因零散分布在第1、3、5、10四个染色体上。在这17个Phi GST基因中,16个基因具有2个内含子,只有OsGSTF3具有1个内含子。所有Phi类蛋白质具有保守的结构域,蛋白质N端较C端更为保守。 2.利用RT-PER鉴定了水稻17个Phi GST基因在正常生长与胁迫条件下,在根、茎、老叶、幼叶和叶鞘中的表达模式。结果发现共有8个基因在所有组织中均表达,预示着这8个GST基因是组成型表达基因;一个基因(OsGSTF10)在所有检测的样品中均未表达;其余8个Phi GST基因在某些特定组织中表达,预示着这些基因发生了功能上的分化。 3.克隆了12个水稻Phi GST基因,并在大肠杆菌中进行高效表达,其中5个Phi GST蛋白在大肠杆菌中以包涵体的形式存在,另外7个以可溶蛋白的形式表达,利用亲和层析纯化了7个可溶性的蛋白,对这7个GST蛋白进行了酶学性质研究。底物活性测定结果显示,有5个蛋白对GST特征底物CDNB有活性,对常见底物NBD-Cl和NBC具有活性的各有4个蛋白,有2个蛋白对DCNB有活性。此外,检测到OsGSTF1有抗除草剂的功能,OsGSTF11对Cumene hydroperoxide有活性,具有一定的抗氧化能力,而OsGSTF10、OsGSTF11阳OsGSTF12对DHAR亚家族特征底物脱氢抗坏血酸具有微弱活性。对4个蛋白进行热力学稳定性检测,发现OsGSTF1具有最高的热稳定性,能够在55℃保持80%以上的活性,而OsGSTF2、OsGSTF4、OsGSTF10稳定性相对较差,推测只能在常温下起作用。收起

关键词 : 谷胱甘肽转移酶基因表达模式蛋白质功能

6. 家蚕谷胱甘肽-S-转移酶基因的功能研究

[学位论文] 余泉友西南大学 2008年博士导师: 鲁成共129页

摘要 : 谷胱甘肽-S-转移酶(GlutathioneS-transferase，GSTs，EC2.5.1.18)是一个多功能的超家族酶类，广泛分布于好氧生物体中。1961年，Booth等首次在大鼠肝脏中发现了谷胱甘肽-S-转移酶的存在，并推测该酶在药物的解毒代谢过程中起着重要作用。GSTs的主要... 展开谷胱甘肽-S-转移酶(GlutathioneS-transferase，GSTs，EC2.5.1.18)是一个多功能的超家族酶类，广泛分布于好氧生物体中。1961年，Booth等首次在大鼠肝脏中发现了谷胱甘肽-S-转移酶的存在，并推测该酶在药物的解毒代谢过程中起着重要作用。GSTs的主要功能是催化谷胱甘肽的巯基与有毒亲电子类物质轭合反应，以达到解毒的目的。此外，GSTs还可以作为配体结合蛋白以俘获有毒物质，行使解毒的功能。GSTS在昆虫对有机磷、有机氯和拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性中起着重要的作用。而且，由于GSTs具有硒非依赖性的谷胱甘肽过氧化物酶活性可以弥补昆虫缺乏硒依赖性的谷胱甘肽过氧化物酶的不足，在抗氧化的过程中也显得非常的重要。因此，对昆虫GSTs功能的研究主要集中于其在杀虫剂抗性与抗氧化中所起的作用。目前，昆虫GSTs分为Delta、Epsilon、Omega、Theta、Sigma和Zeta六个已知的家族，另外一些不能被划分到已知家族的GSTs暂归为unclassified，其中与杀虫剂抗性相关的主要为昆虫特异的Delta和Epsilon家族的GSTs。家蚕是一种重要的经济昆虫，对杀虫剂非常敏感，极易受到杀虫剂的危害而导致蚕桑生产业遭受重大经济损失。另外，约70％的农林害虫属于鳞翅目，家蚕作为鳞翅目昆虫的模式生物，是目前唯一完成了基因组测序的鳞翅目昆虫。因此，从生理学水平、基因组水平对家蚕GST基因功能进行研究，不仅能为家蚕抗性品系的育成提供理论依据，也可为开展鳞翅目昆虫的生物防治奠定基础。本研究获得的主要结果如下：1.家蚕GSTs相关的生理学研究酶的生理学特性是其基因功能的重要表现之一，为此，首先对GSTs在家蚕各组织、各发育时期的活性等生理学特性进行了分析。以CDNB为底物，对家蚕大造品系5龄第3天的9个组织的GSTs活性测定表明，在所测组织中均有GSTs活性。其中，头部的比活力最高，其次是脂肪体和中肠。脂肪体的Ks(CDNB)值大于中肠，表明脂肪体GSTs对CDNB的亲和力小于中肠；而脂肪体的Vmax(CDNB)大于中肠，表明脂肪体GSTs的催化效率高于中肠。但有趣的是，家蚕头部GSTs对CDNB的亲和力和催化效率均高于中肠和脂肪体。以枯烯过氧化氢(CHP)为底物，发现9个组织中均有硒非依赖性的谷胱甘肽过氧化物酶活性。与CDNB不同的是，马氏管、卵巢、精巢和丝腺中的GSTS对CHP的比活力相对较高。生殖腺具有较高的过氧化物酶活性，我们推测这可能在防止活性氧物质对生殖细胞造成损伤中起重要作用。在家蚕各发育时期(卵——幼虫——蛹——蛾)，GSTs活性呈现一定的规律性变化。在整个发育时期都能检测剑GSTs对CDNB的活性，其中卵期的比活力最低，蚁蚕期出现一个活性小高峰，5龄第3天GSTs的比活力达到最高。第2天蛹的活性为34.505±2.285nmol/(mgpro-min)，显著高于高于5龄起蚕的27.335±2.111nmol/(mgpro-min)；第1天蛾的活性与5龄起蚕相似，不存在显著性差异。以LC50的辛硫磷处理5龄第3天的大造后，蚕体内发生了显著的氧化应激反应。对反映氧化应激水平的生物标记物——丙二醛的含量测定表明，辛硫磷处理后12h，脂肪体中诱导产生的MDA含量达到最高峰，是对照的4.11倍；12h后，MDA开始下降，到24h与对照基本一致。中肠组织中，36h处理与对照的MDA含量比率达剑最大值(3.156)，48h后中肠MDA含量恢复剑止常水平。辛硫磷处理20h后，脂肪体中的GSTs的表达即受剑一定程度的诱导，GSTs对CDNB和枯烯过氧化氢(CHP)的活性显著增加，分别在42h和48h酶活性恢复到正常水平；而在中肠组织中，GSTS对CDNB和CHP的活性分别在20h和16h显著增加，分别在24h和30h恢复剑正常水平。因此，辛硫磷处理家蚕后能诱导GSTs活性的增强，而且增加的GSTs活性可能在缓解氧化应激反应起重要作用。2.家蚕GST基因的生物信息学分析通过对家蚕全基因组的分析，共鉴定出23个胞质谷胱甘肽-S-转移酶基因，基因数目上与双翅目昆虫较为接近，而远远超过蜜蜂的GST基因数(8个基因)。昆虫特异的Delta和Epsilon两个家族在家蚕中也有显著扩增的现象，分别有4和8个基因。另外，Omega家族也有大量的扩增，共鉴定出4个基因。与其他昆虫类似，家蚕GST基因在基因组中有呈簇分布的特征。但Epsilon家族的8个基因中，仅el、e4和e5三个基因串联分布在一起，其他的基因却散布于基因组中，这暗示着其重复机制的不同。相对于双翅目昆虫GSTs而言，家蚕GST基因的内含子数目较多，长度也较长。对家蚕GST基因的一些长内含子分析发现，其间存在数目众多的转座子序列。因此，我们推测这可能是由于家蚕基因组中存在大量的转座子或其残余等重复序列而使家蚕的GST基因内含子数目增多和长度增加。3.家蚕GST基因的表达模式与克隆ESTs数据分析表明，除BmGSTe2、BmGSTe6、BmGSTe8和BmGSTo4四个基因外，其他基因均有ESTs证据，并且在家蚕“卵——幼虫——蛹——蛾”的整个发育时期都有GST基因的表达。不同家族的GST基因ESTs数目及组织分布存在较大的差异，这些差异可能反映出了它们在家蚕的发育和在有毒物质的解毒过程中起着不同的作用。以GST基因在“熟蚕——蛾”发育时期的表达谱芯片进行聚类，聚类图分为高表达和低表达/不表达两大类群。高表达的基因中有4个为Delta和Epsilon家族的GSTs，其中BmGSTd3和BmGSTe5在发育时期和雌雄间均表现出了明显的差异。其他高表达基因为非昆虫特异的GSTs，它们在“熟蚕——蛾”时期几乎都有表达，而且雌雄间表达量人致相似。大部分低表达或不表达的基因为昆虫特异的GSTs，其在雌雄间的表达量也存在一定的差异。ESTs和芯片数据结果表明，昆虫特异的GSTS在发育时期和雌雄间的表达存在一定差异，可能与其功能相关。RT-PCR结果表明，23个家蚕GST基因都有表达。非昆虫特异的家族几乎在所有分析的8个组织中都有表达，而且表达量较高。相反，大部分昆虫特异的家族以及未分类的(unclassified)GST基因表现出了较强的组织特异性，特别是BmGSTe2和BmGSTe6基因仅在中肠中有表达，且表达量较低。大部分的Delta和EpsilonGSTs在中肠和脂肪体中表达量较低或不表达，这可能是家蚕对杀虫剂敏感的原因之一。以LC50的辛硫磷处理家蚕后，用RT-PCR和定量PCR方法检测到BmGSTe8在处理后24、30、36和42h其表达量显著上调，表明BmGSTe8在氧化应激反应中能被诱导表达，并可能在这一过程中起重要作用。另外，我们以RT-PCR方法对家蚕的12个GST基因进行了克隆，获得了其完整的CDS。4.杀虫剂对家蚕汰选后GSTs的表达变化辛硫磷和甲氰菊酯对家蚕19-440品系分别汰选5代和4代后，LD50分别是F0(未筛选的19-440品系)的1.78和4.18倍。相对而言，甲氰菊酯对家蚕选择后抗性发展速度较快。辛硫磷对家蚕汰选5代(F5)后，脂肪体中的GSTs对CDNB和CHP的比活力在雌雄中都有显著的增加；在雌雄的中肠组织中GSTs对ClIP的比活力也均有显著的增加，而以CDNB为底物时，仅雌性家蚕GSTs的比活力有显著的诱导。甲氰菊酯对19-440汰选4代(F4)后，雌雄脂肪体中的GSTs对CDNB的比活力也都有显著的增加，分别是对照(F0)的1.13和1.20倍；中肠的GSTs对CHP的活性也有显著增加。2种杀虫剂对家蚕汰选后脂肪体和中肠GSTs的Km(CDNB)基本保持不变，Vmax(CDNB)的值与酶的比活力测定结果相似。酶的动力学参数结果表明，辛硫磷和甲氰菊酯对家蚕汰选后，酶活性的增加可能主要通过GST基因的转录调节的方式进行调控。以RT-PCR和定量PCR对GST基因转录水平检测，发现BmGSTe3和BmGSTe2分别在脂肪体和中肠中上调表达。因此，BmGSTe3和BmGSTe2的转录上调可能导致了GSTs酶活性的增加，这也可能是杀虫剂汰选后家蚕抗性增强的重要原因之一。5.BmGSTe3在Bac-to-Bac系统中的表达将可能参与杀虫剂抗性的重要基因BmGSTe3重组到Bacmid质粒上，获得重组质粒Baemid-BmGSTe3，并进行真核表达。在脂质体Cellfectin的介导下，Bacmid-BmGSTe3转染Sf9细胞，分离获得病毒液。以杆状病毒液感染sf9细胞72h后，收集细胞培养液和细胞沉淀进行SDS-PAGE分析，均有目的条带(27.4kD左右)，表明BmGSTe3在Sf9细胞中成功表达。以P4代重组病毒储液感染Sf9细胞，在感染后72h的培养液和细胞裂解液中都检测到了GSTs对CDNB活性，并且重组病毒转染后的比活力均显著高于野生型。活性测定结果进一步证实了BmGSTe3在sf9细胞中得到正确表达，而且BmGSTE3有较高的CDNB活性。收起

关键词 : 家蚕谷胱甘肽转移酶基因

7. 褶纹冠蚌谷胱甘肽硫转移酶基因的克隆与表达分析

[学位论文] 张飞南昌大学 2018年硕士导师: 文春根共73页

摘要 : 褶纹冠蚌 (Cristaria plicata) 软体动物门，蚌科，我国常见育珠蚌之一，易被感染引发疾病，增加养殖行业风险，因而，进行贝类分子免疫方面的研究意义重大。本文运用巢氏 PCR 和 RACE PCR克隆得到了褶纹冠蚌Mu 型和 Theta 型谷胱甘肽硫转移酶基... 展开

关键词 : 褶纹冠蚌谷胱甘肽硫转移酶基因克隆重组蛋白基因表达

8. 多药耐药因子（LRP、p-gp、GST-π）在胆囊组织中的表达与胆囊病变的关系

[学位论文] 董坤贵阳医学院 2010年硕士导师: 孙诚谊；黄志刚共29页

摘要 : 目的:通过研究肺耐药蛋白(LRP)、P糖蛋白(P-gp)、谷胱甘肽S转移酶π(GST-π)在慢性胆囊炎、非胆固醇性胆囊息肉（胆囊良性肿瘤）、胆囊恶性肿瘤中的表达及分布的差异来观察以上三种多药耐药因子与胆囊病变恶性程度之间的关系，以便为逆转胆囊癌耐药性... 展开

关键词 : 胆囊癌肺耐药蛋白 P糖蛋白谷胱甘肽S转移酶&pi 基因表达

9. 嗜热四膜虫中谷胱甘肽合成基因的鉴定与功能分析

[学位论文] 呼丽娜山西大学 2021年硕士导师: 王伟共88页

摘要 : 谷胱甘肽(Glutathione，GSH)是一种具有抗氧化和解毒重金属功能的硫醇小分子三肽，广泛存在于各种生物体中。GSH在生物体内的含量远高于金属硫蛋白、植物螯合肽等解毒重金属多肽，其通过巯基螯合金属离子，并与GPX酶共同作用来保护生物体。通过对其调... 展开谷胱甘肽(Glutathione，GSH)是一种具有抗氧化和解毒重金属功能的硫醇小分子三肽，广泛存在于各种生物体中。GSH在生物体内的含量远高于金属硫蛋白、植物螯合肽等解毒重金属多肽，其通过巯基螯合金属离子，并与GPX酶共同作用来保护生物体。通过对其调控基因的改造实现生物体对有害金属耐受性的增强和谷胱甘肽生产能力的提高，具有重要的理论意义和应用价值。嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)是一种自由生单细胞纤毛类原生动物，无细胞壁，对环境污染物敏感，具有环境相适应的重要功能基因家族，是经典的探究细胞对环境污染物的降解和解毒、高效抗氧化效应的模式生物。本研究以嗜热四膜虫为研究对象，鉴定了GSH合成途径的谷氨酰半胱氨酸合成酶基因和谷胱甘肽合成酶基因,对基因的功能进行了分析，获得的结果如下： 1.嗜热四膜虫谷胱甘肽合成基因GSH1和GSH2的生物信息学分析基于嗜热四膜虫基因组数据库和功能基因组数据库，通过生物信息学分析，鉴定出嗜热四膜虫谷胱甘肽合成途径的关键酶γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因GSH1(TTHERM_00250970)和谷胱甘肽合成酶基因GSH2(TTHERM_01049360)。GSH1开放阅读框1881bp，编码626个氨基酸；GSH2开放阅读框1938bp，编码645个氨基酸。GSH1和GSH2在营养生长期、饥饿期、有性生殖期表达，接合配对诱导表达水平的显著上调。在金属离子Cd2+和Pb2+的胁迫下，野生型嗜热四膜虫的GSH1和GSH2表达水平显著上调。GSH1和GSH2分别进行系统发育分析，发现两个基因，具有相似的进化分支，存在协同进化模式。蛋白质相互作用分析发现二者均与合成谷胱甘肽的前体物质半胱氨酸合成相关的蛋白存在相互作用。 2.GSH1敲除突变体细胞对Cd2+和Pb2+的敏感性增强构建GSH1基因敲除载体pNeo4-GSH1，基因枪转化嗜热四膜虫，通过同源重组和抗性筛选，获得GSH1基因敲除突变体细胞株KO-GSH1。在Cd2+和Pb2+的胁迫下，野生型细胞的IC50值分别为30.77μM、15.35μM，而KO-GSH1细胞的IC50值分别为26.46μM、13.39μM，GSH1的敲除导致细胞对重金属离子胁迫的敏感性增强。进一步分析发现，KO-GSH1细胞中谷胱甘肽的含量下降了85%；在Cd2+和Pb2+的胁迫下，KO-GSH1细胞中谷胱甘肽的含量分别下降了95%和94%，野生型细胞株谷胱甘肽的含量下分别下降了55%和53%。然而，在Cd2+和Pb2+胁迫下，KO-GSH1 细胞的MTT1、MTT3和MTT5以及抗氧化酶基因SOD1、GPX1和CAT基因表达水平均显著上调，结果表明KO-GSH1突变体通过上调金属硫蛋白基因和抗氧化酶基因的表达水平来抵抗Cd2+和Pb2+的胁迫。 3.GSH1和GSH2基因过表达细胞对Cd2+和Pb2+的耐受性增强构建MTT1启动子调控下的过表达载体pXS75-GSH1和pXS75-GSH2，基因枪转化嗜热四膜虫，筛选获得过表达细胞株OE-GSH1和OE-GSH2。免疫荧光定位分析表明，HA-Gsh1和HA-Gsh2均定位在细胞质中。在Cd2+和Pb2+胁迫下OE-GSH1的IC50分别为35.15μM、18.13μM，OE-GSH2的IC50分别为33.98μM、17.58μM均高于野生型，表明OE-GSH1和OE-GSH2均对Cd2+和Pb2+的耐受性增强。在Cd2+和Pb2+胁迫下，OE-GSH1和OE-GSH2突变体中的GSH1和GSH2的表达水平均显著上调，谷胱甘肽的含量均显著上升。然而金属硫蛋白基因MTT1、MTT3和MTT5以及抗氧化酶基因SOD1、GPX1和CAT的表达水平显著下降。结果表明，OE-GSH1和OE-GSH2细胞通过上调GSH1和GSH2的表达水平增加谷胱甘肽的含量以此来增加对Cd2+和Pb2+的耐受性，谷胱甘肽、金属硫蛋白和抗氧化酶系统协同参与了四膜虫对Cd2+和Pb2+的解毒功能。综上所述，本研究首次鉴定了四膜虫GSH合成基因，γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因GSH1和谷胱甘肽合成酶基因GSH2，嗜热四膜虫GSH1敲除突变体中谷胱甘肽合成下降。在重金属离子胁迫下，敲除突变体细胞中的金属硫蛋白相关基因和抗氧化相关基因表达上调。相反，GSH1和GSH2的上调表达，导致金属硫蛋白相关基因和抗氧化相关基因表达下调。在环境重金属胁迫下，GSH合成途径和金属硫蛋白及抗氧化酶系统存在相互功能补偿，在四膜虫重金属离子解毒过程中发挥重要的调节作用。收起

关键词 : 嗜热四膜虫谷胱甘肽基因鉴定重金属耐受性金属硫蛋白

10. 核盘菌诱导下向日葵转录组构建及防卫相关基因功能研究

[学位论文] 马立功东北林业大学 2015年博士导师: 王志英；张匀华共159页

摘要 : 核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)作为向日葵菌核病的病原，广泛分布于世界各向日葵产区。菌核病也是我国重要油料作物—向日葵（Helianthusannuus）的主要病害之一，经常猖獗发生，严重影响向日葵的产量和质量。种植抗病品种是该病害最经济、有效的控... 展开核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)作为向日葵菌核病的病原，广泛分布于世界各向日葵产区。菌核病也是我国重要油料作物—向日葵（Helianthusannuus）的主要病害之一，经常猖獗发生，严重影响向日葵的产量和质量。种植抗病品种是该病害最经济、有效的控制措施，通过寻找抗病基因来培育抗病品种对防治向日葵菌核病具有重要意义。本研究以向日葵品种龙食葵2号为材料，通过RNA-Seq测序技术分析向日葵在核盘菌胁迫过程中差异表达基因，筛选鉴定与抗病相关基因，为向日葵抗逆分子育种提供科学依据和优良抗病基因资源。利用RNA-Seq测序技术，获得了核盘菌诱导向日葵处理组(HaSs)与对照组(HaCon)原始碱基数分别约为2Gb数据，经denovo组装后，HaSs和HaCon样本分别获得66313和61672个Unigene，对组装后得到的Unigene进一步序列拼接和去冗余，共获得非冗余Unigene为72550个，其中有53916条基因获得功能注释。采用RPKM法计算核盘菌侵染向日葵后差异基因表达情况，获得差异表达基因14970个，其中上调表达基因有8302个，下调表达基因有6668个。对差异表达基因进行GO和KEGG功能富集，结果表明，比对上的Unigene被归类到54个GO功能类别中，其中参与生物学过程的22个、细胞组成的17个、分子生物学功能的15个。Pathway聚集分析显示，差异表达基因显著富集在52条Pathway中，其中与植物抗逆响应关系密切的有植物激素信号转导途径、植物与病原菌互作途径、苯丙烷类代谢途径、类黄酮生物合成途径、黄酮和黄酮醇生物合成途径和角质、软木质和蜡生物合成途径等抗病相关代谢途径。可见，核盘菌诱导激发了向日葵多种抗病信号传导途径及防御反应，暗示向日葵对核盘菌侵染响应的分子机制受到多基因网络系统的调控。在对上述差异表达基因分析的基础上，对向日葵防御和激素信号传导途径相关基因进行了研究。结果表明，当核盘菌侵染向日葵时，向日葵防御酶基因表达量与对照相比均有显著的变化，Sod、Pod和Gst基因在6h时表达量分别为对照25.02、22.34和26.25倍;Pal、Cat和Chs基因在12h时均达到最高，分别为对照的23.89、24.23和24.89倍;Glu和Chi基因先下调后上调表达，在24h和36h时的表达量分别为对照的23.66和22.13倍。向日葵水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)及茉莉酸-乙烯(JA/ET)信号途径中的调控基因与未经诱导的相比均有明显的转录水平变化，而且JA/ET途径“节”点PDF1.2基因和SA-JA“节”点基因NPR1、MPK4和EDS1也明显上调表达，说明以上各信号途径相互交叉参与了向日葵对核盘菌的诱导响应，且SA信号途径较早于其它途径。从核盘菌诱导向日葵转录组文库中筛选出了15个推测的GSTs全长基因，并对这些基因进行了特性描述、系统进化及诱导表达分析。这15个GSTs基因分属5个基因家族，其中Tau家族为6个，Phi家族为3个，Zeta家族、Theat家族和Lambda家族分别为2个。Tau类、Zeta类和Lambda类GST在叶、花中相对表达量显著高于其它组织，Phi类GST在根、叶中相对表达量较高，Theat类GST在叶中相对表达量高于其它组织。以上结果说明，GSTs基因在向日葵不同器官中表达具有组织特异性。当向日葵叶片受草酸、核盘菌及其代谢物诱导处理时，HaGSTta1、HaGSTp3和Zeta类GST(HaGSTz1、HaGSTz2)显著上调表达，其它大部分GSTs基因转录水平为下调表达;当向日葵根受盐和干旱胁迫时，除了HaGSTth1、HaGSTp1和HaGSTp3下调表达外，其它GST基因转录水平均显著上调表达。这表明向日葵GSTs基因在生物和非生物胁迫应答中可能起着重要的作用。从差异表达基因中筛选了一个病程相关蛋白1基因进行了功能分析，该基因cDNA全长开放阅读框为489bp，编码162aa，具有6个保守半胱氨酸，4个allergenV5/Tpx-1related保守结构域，命名为HaPR-1（GenBank登录号为KR071874）;BlastP分析HaPR-1蛋白具有完整的SCP超家族保守结构域，与多种植物PR1高度同源。HaPR-1基因在向日葵叶中表达量最高，根、盘、种和花中次之，茎中最低。干旱、盐、草酸、核盘菌及其代谢物均可显著诱导其表达，其中草酸、核盘菌及其代谢物诱导叶片后HaPR-1基因表达量较对照提高4.07～14.52倍。将该基因在烟草中过量表达，提高了转基因株系对核盘菌的抗性。对抗性株系烟草叶片防御酶活性及丙二醛含量测定发现转基因烟草在核盘菌胁迫下显著提高了SOD、POD和CAT酶活性，降低了MDA含量。初步推断HaPR-1具有抗核盘菌的功能。验证了15个GST家族中的2个抗核盘菌成员的功能。HaGSTta1和HaGSTp3基因分别编码224和212aa，均含有底物结合位点（H位点）和GSH结合位点（G位点）。经BlasP序列比对和系统进化分析表明，HaGSTta1和HaGSTp3分别属于Tau和Phi家族，GenBank登录号分别为KR071872和KR071873。HaGSTta1在向日葵叶中表达量最高，在盘中的表达量最低。HaGSTp3基因在根中的表达量最高，在茎中的表达量最低。干旱、盐、草酸、核盘菌及其代谢物均能诱导HaGSTta1和HaGSTp3上调表达。为研究HaGSTta1和HaGSTp3的功能，分别将这两个基因在烟草中过量表达，提高了转基因株系对核盘菌及草酸的抗病性。对抗性株系叶片中解毒酶活性测定发现，转基因烟草在核盘菌胁迫下显著提高了谷胱甘肽-s-转移酶(GST)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活性。初步推断HaGSTta1和HaGSTp3具有抗核盘菌的功能。收起

关键词 : 向日葵核盘菌转录组病程相关蛋白1基因谷胱甘肽S-转移酶基因