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[学位论文] 陈小怡广西医科大学 2021年硕士导师: 陈晓共88页

摘要 : 目的：腱-骨界面的修复过程一般都是疤痕组织的形成，无法恢复到天然的形态及结构，也很难达到理想的生物力学强度效果。随着对天然腱-骨结构的微观解析，界面结构与其功能的紧密联系的重要性也愈加突显，模仿天然组织结构的组成来改善受损组织的再生... 展开目的：腱-骨界面的修复过程一般都是疤痕组织的形成，无法恢复到天然的形态及结构，也很难达到理想的生物力学强度效果。随着对天然腱-骨结构的微观解析，界面结构与其功能的紧密联系的重要性也愈加突显，模仿天然组织结构的组成来改善受损组织的再生修复策略成为了组织工程新的选择。磷酸钙液态前驱体（CaP-PILP）,一种数纳米尺度的矿化材料，可作为基元实现精确的仿生矿化，从而实现肌腱-骨界面的仿生重构。意义：本研究旨在利用磷酸钙液体前驱体矿化肌腱组织使其成为骨组织，构建高仿生肌腱-骨移行的复合组织装配材料：磷酸钙液态前驱体矿化肌腱薄片组织（PILP-tendon），促进肌腱-骨组织缺损修复。研究将为磷酸钙液态前驱体矿化肌腱薄片组织的肌腱-骨组织工程的临床化应用提供重要的理论依据。方法：1、优质天然猪的肌腱经过剥离筋膜、冻融法脱细胞等步骤使其脱细胞，脱细胞肌腱经低浓度戊二醛的交联作用，固定于冷冻包埋剂中冰切获得80微米的脱细胞肌腱薄片组织。2、配制磷酸钙液态前驱体，并将脱细胞肌腱薄片组织浸泡其中，获得磷酸钙液态前驱体矿化肌腱薄片组织。3、通过投射电镜（Transmission electron microscopy，TEM）、扫描电镜（Scanning electron microscop，SEM）、能谱仪（Energy Dispersive Spectrometer，EDS）、傅立叶红外光谱仪（Fourier Transform Infrared Spectrometer，FTIR Spectrometer）、X射线衍射（Diffraction of x-rays,XRD）、热重及差示扫描量热仪（Thermal Gravimetric Analyzer,TGA）、深度敏感压痕技术（Depth-Sensing Indentation,DSI）等对磷酸钙液态前驱体矿化肌腱薄片组织进行表征。4、CCK-8细胞增殖分析与活死细胞染色检测磷酸钙液态前驱体矿化肌腱生物相容性。5、检测磷酸钙液态前驱体矿化的肌腱薄片组织对间充质干细胞细胞系（C3H）向骨系分化能力。6、在小鼠动物异位成骨的体内模型中，通过小动物活体断层扫描成像系统（micro-CT）、定量分析和组织学染色检测磷酸钙液态前驱体矿化肌腱薄片组织在体内促进成骨情况。7、在大鼠髌腱-骨缺损模型中，通过万能材料试验机进行力学测试，通过组织学染色评估髌腱-骨的修复情况，TEM观察组织胶原纤维的多少，了解修复肌腱-骨超微结构。结果：1、磷酸钙液态前驱体矿化肌腱薄片组织有明显的钙机磷酸基团的特征，电镜结果也显示肌腱胶原内有矿化现象，说明矿化肌腱薄片组织内部有钙磷沉积；2、CCK-8细胞增殖分析与活死细胞染色结果表明磷酸钙液态前驱体矿化肌腱薄片组织不影响细胞生长与增殖，扫描电镜结果显示种植在矿化肌腱组织上的C3H细胞形态会发生改变；3、在磷酸钙液态前驱体矿化肌腱薄片组织影响下，C3H细胞表现出较高的碱性磷酸酶活性，免疫荧光染色中骨系相关因子表达明显，qPCR中骨质分化标志的基因表达水平明显高于对照组；4、在小鼠异位成骨的体内模型中，结果提示磷酸钙前驱体矿化肌腱薄片组织种植在皮下有新生的骨组织，种植在骨髓道中可与其内表面骨质交叉融合生长；5、在大鼠髌腱-骨缺损模型中，发现磷酸钙液态前驱体矿化肌腱薄片组织的力学性能较对照组有增强；TEM结果显示有明显的骨胶原纤维生成，组织学结果显示了肌腱-骨组织缺损部位的有新生的骨组织和过渡区域。结论：该研究验证了磷酸钙液态前驱体能够矿化肌腱薄片组织，使肌腱胶原内矿化，促进肌腱胶原向骨胶原转化。磷酸钙液态前驱体与肌腱胶原装配构建的PILP-tendon，不仅具有良好的生物相容性，促进间充质干细胞系成骨分化，还在体内实现了肌腱-骨复合组织的仿生重构。收起

关键词 : 腱骨连接处磷酸钙液态前驱体仿生矿化组织修复

2. 基于大孔介孔硅纳米粒子的仿生矿化前驱体转运系统的构建

[学位论文] 韦盛华中科技大学 2019年博士导师: 吴华共109页

摘要 : 目的: 骨缺损是临床上最常见的疾病之一，常由肿瘤、外伤、感染等疾病造成。大面积的骨缺损常常使用自体骨或者异体骨移植进行治疗。然而，受限于自体骨的有限来源和异体骨的吸收排斥反应等，开发更优的人工骨支架材料成为迫切需要解决的问题。在... 展开目的: 骨缺损是临床上最常见的疾病之一，常由肿瘤、外伤、感染等疾病造成。大面积的骨缺损常常使用自体骨或者异体骨移植进行治疗。然而，受限于自体骨的有限来源和异体骨的吸收排斥反应等，开发更优的人工骨支架材料成为迫切需要解决的问题。在骨组织工程中，常常使用支架材料为细胞生长提供3D环境，使用骨髓间充质干细胞和生长因子等作为成骨诱导补充剂进行骨再生的优化。但是大量使用生长因子如骨形态蛋白等已经被证实可能会带来如异位成骨、脂肪液化等不良影响，因此探索一种非生长因子类的材料作为成骨补充剂具有重要意义。随着人们对骨组织构成和形成过程认知的增加，基于胶原纤维的生物材料被广泛应用于骨组织工程中。骨组织是蛋白质、矿物质和胶原纤维等的混合物，由纤维内矿化的胶原纤维作为物理组织结构的第二层级，为骨组织提供了物理应力结构基础。在骨基质的研究中，通过使用多聚物诱导的液体样前驱体（polymer-induced liquid-precursor）生成无定形磷酸钙仿生矿化前驱体（ amorphous calcium phosphate biomineralization precursors ， ACP biomineralization precursors），能成功获得胶原纤维内矿化。在这个生物矿化的过程中，多聚物通过螯合饱和钙磷溶液中的钙离子和磷离子形成无定形磷酸钙仿生矿化前驱体。这种无定形磷酸钙仿生矿化前驱体通过粘附在胶原纤维上的特定位点渗透进入胶原纤维内部，进行结晶固化，最终形成沿着胶原纤维长轴排列的羟基磷灰石矿物晶体。这种无定形磷酸钙作为骨形成过程中的基本原料，除了具有促进胶原纤维内矿化的性能外，亦被证实可以调节细胞功能和组织分化。因此，这种无定形磷酸钙仿生矿化前驱体具有作为成骨补充剂的潜能。但是无定形磷酸钙仿生矿化前驱体的液态样特性限制了其原位矿化胶原纤维的局部使用，因此需要一种转运体系将其转运至特定部位以开发更多临床应用潜能。介孔硅（mesoporous silica nanoparticle，MSN）具有较好的生物相容性和客体负载性能，已经作为物质转运体系广泛运用于生物活性因子转运，也为转运仿生矿化前驱体提供了思路。在本实验研究中，通过合成羧基化的大孔径介孔硅，构建仿生矿化前驱体转运体系，对所制备材料的理化性能、诱导胶原纤维内矿化性能和机制以及体外成骨诱导性能进行研究，探索其作为成骨补充剂的应用潜能。方法: 实验主要概括为以下几个内容：一. 以合成的传统MCM-41型介孔硅为模板，利用扩孔剂三甲苯（TMB）进行孔径扩大，制备具有超大孔径的单分散介孔硅体系。利用3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）氨基功能化在介孔硅表面接枝氨基功能基团，然后使用琥珀酸酐（succinic anhydride）开环反应在介孔硅表面接枝羧基基团-COOH ，获得表面羧基功能化的大孔介孔硅(carboxylate-functionalized large pore mesoporous silica, CLMSN)。使用CLMSN负载聚丙烯胺盐酸盐(poly allylamine hydrochloride，PAH)介导的无定形磷酸钙（amorphous calcium phosphate，ACP）PAH-ACP，获得PAH-ACP@CLMSN。对合成步骤中所得的纳米粒子LMSN、CLMSN、和PAH-ACP@CLMSN进行物理化学表征分析，通过透射电镜（ transimission electron microscopy, TEM ）、能量色散X射线广谱检测（ energy dispersive x-ray spectroscopy, EDS ）、X-射线粉末（ powder X-Ray diffraction，XRD）、热重分析（thermogravimetric analysis, TGA）、zeta电位测试、傅里叶红外变换光谱分析（fourier transform infrared spectroscopy， FTIR）、光电子能谱分析（X-ray photoelectron spectrograph，XPS）、氮气吸附脱附实验（nitrogen adsorption and desorption experiment）综合验证表面羧基功能化及PAH-ACP的负载。二. 通过电感耦合等离子体原子发射光谱仪（ inductively coupled plasma optical emission spectroscopy，ICP-OES）测定纳米粒子中Si、P、Ca粒子的释放动力学以获得纳米粒子中仿生矿化前驱体的释放动力学，同时使用TEM对纳米粒子的生物降解性能进行检测。使用纳米粒子对 2D 胶原纤维进行仿生矿化，探索PAH-ACP@CLMSN系统中仿生矿化前驱体释放、粘附并进入胶原纤维内进行晶核反应获得胶原纤维内矿化的机制，并使用3D胶原海绵对PAH-ACP@CLMSN胶原纤维内矿化能力进行进一步验证。三.使用大鼠骨髓间充质干细胞（rBMSCs）和巨噬细胞系RAW264.7对不同浓度的LMSN和PAH-ACP@CLMSN进行生物相容性评价（ CCK-8法）。使用流式细胞仪检测PAH-ACP@CLMSN对rBMSCs细胞凋亡有无影响。通过检测LMSN和PAH-ACP@CLMSN纳米粒子对COL I、OPN、OCN、RUNX2基因、碱性磷酸酶活性、和细胞外钙化结节沉积的影响，初步判断其是否具有成骨诱导潜能。同时使用TEM、ICP-OES检测巨噬细胞对纳米粒子的吞噬作用。将FITC荧光颗粒整合至CLMSN中，对PAH-ACP@FITC-CLMSN粒子的摄取进行免疫荧光分析，检测纳米粒子对rBMSCs细胞骨架的影响。结果: 一. 在高温高压扩孔剂反应下，有效地获得了介孔直径约为14.88nm的大孔介孔硅纳米颗粒；成功对介孔硅表面进行了羧基功能化，这种羧基功能化不仅有利于PAH-ACP前驱体的负载，更为后续介孔硅在生物体系内应用的实验中展现优异的生物相容性打下基础。PAH-ACP前驱体能有效负载于CLMSN中，这将有利于后续胶原纤维矿化及成骨的应用。二. 仿生矿化前驱体的释放动力学曲线证明CLMSN能在溶液中有效转运和释放仿生矿化前驱体PAH-ACP，其释放的过程为10天内的快速释放和10-30天内的缓慢释放。PAH-ACP@CLMSN在胶原纤维外释放的仿生矿化前驱体通过侧向扩散、粘附在胶原上特定位点后进入胶原纤维内，进一步通过晶体成核反应进行胶原纤维内仿生矿化。这种仿生矿化转运体系对2D和3D胶原的纤维内矿化均有效。PAH-ACP@CLMSN的降解从早期即开始，大约60天后完成其降解，这种降解速率对于仿生矿化转运体系没有不良影响。三. 经羧基化改性后的PAH-ACP@CLMSN对大鼠骨髓间充质干细胞和巨噬细胞均具有优异的生物相容性，具有良好的生物学应用基础。巨噬细胞对PAH-ACP@CLMSN和LMSN的内化作用不需要特别的介质介导，在与细胞接触的早期即可产生内化作用。巨噬细胞对纳米粒子的内化作用未对巨噬细胞形态产生不良影响。大鼠骨髓间充质干细胞对PAH-ACP@CLMSN和LMSN的内化作用对细胞骨架细胞形态和细胞功能未产生不良影响。PAH-ACP@CLMSN相较于LMSN和未添加纳米粒子的空白组而言，能有效增加ALP活性、促进细胞外矿化结节的形成、促进成骨相关基因的表达，具有诱导骨髓间充质干细胞成骨分化性能。结论: 综上，PAH-ACP@CLMSN作为一种释放PAH-ACP仿生矿化前驱体的大孔纳米颗粒，兼具胶原纤维内仿生矿化和促进骨髓间充质干细胞成骨分化的性能，具有作为成骨相关组织工程中的成骨诱导补充剂的潜能。收起

关键词 : 骨组织工程支架材料羧基功能化大孔介孔硅无定形磷酸钙仿生矿化前驱体纤维内矿化