摘要: 乳脂含量在一定程度上影响着牛奶的品质。在反刍动物中，日粮经瘤胃微生物发酵产生的乙酸作为乳脂合成前体物质。体内体外实验都已证明乙酸可以调节奶牛乳腺上皮细胞的乳脂合成。酰基甘油-3-磷酸酰基转移酶 6(1-acylglycerol-3-phosphate-O-acyltrans... 展开 乳脂含量在一定程度上影响着牛奶的品质。在反刍动物中，日粮经瘤胃微生物发酵产生的乙酸作为乳脂合成前体物质。体内体外实验都已证明乙酸可以调节奶牛乳腺上皮细胞的乳脂合成。酰基甘油-3-磷酸酰基转移酶 6(1-acylglycerol-3-phosphate-O-acyltransferase 6,AGPAT6)是奶牛乳脂合成过程中的关键酶。本实验室团队前期实验已经明确乙酸可以调节AGPAT6的表达，进而促进乳脂合成，但乙酸调节AGPAT6表达的分子机制尚不明确。 核受体亚家族 1H 成员 3(Nuclear receptor subfamily 1 group H member 3,NR1H3)是配体依赖的核激素受体超家族成员，在脂质代谢旺盛的组织中高表达，参与机体胆固醇稳态和脂质合成的调节。水牛和奶山羊中的研究显示NR1H3可以调节乳脂合成相关基因的表达。但在奶牛乳腺中NR1H3的表达模式以及其是否参与乙酸诱导的AGPAT6表达调节还不清楚。 为明确NR1H3在奶牛乳腺组织中的表达模式以及其与乳脂合成之间的关系，本研究首先采用荧光定量PCR和Western blot方法检测青春期、泌乳期和干奶期奶牛乳腺组织中的NR1H3的表达变化。结果显示泌乳期乳腺组织中NR1H3 mRNA和蛋白表达水平显著高于青春期和干奶期（P＜0.01)，提示NR1H3的表达与乳腺泌乳功能相关。在体外培养的奶牛乳腺上皮细胞中，添加NR1H3的激活剂T0901317处理可以显著提高NR1H3的表达和细胞中甘油三酯(Triacylglycerol,TAG)的含量。采用RNAi的方法干扰细胞中NR1H3的表达，得到相反的结果，表明NR1H3可以正向调节奶牛乳腺上皮细胞中乳脂的合成。 为研究乙酸是否可以诱导NR1H3的表达，并通过NR1H3调节AGPAT6的表达和乳脂合成，本研究首先采用12mM乙酸钠处理奶牛乳腺上皮细胞，荧光定量PCR和Western blot结果显示乙酸钠作用下细胞中NR1H3 mRNA和蛋白表达水平显著增加(P＜0.01),同时过氧化物酶体增殖物激活受体 γ(Peroxisome proliferator-activated receptor γ,PPARγ)和 AGPAT6 的表达也显著上调。当采用基因干扰的方法干扰乙酸钠处理的奶牛乳腺上皮细胞中NR1H3的表达，乙酸钠对AGPAT6的表达的诱导作用以及对TAG合成的促进作用被抑制。在干扰NR1H3的同时过表达AGPAT6,NR1H3对TAG合成的抑制作用恢复，表明在乙酸诱导的AGPAT6表达和乳脂合成过程中，NR1H3介导这一过程。 本实验室前期已经发现PPARγ参与乙酸对AGPAT6表达的调节。为进一步明确NR1H3是否参与了乙酸-PPARγ-AGPAT6的表达调控，本研究通过免疫共沉淀实验研究NR1H3与PPARγ之间的相互作用。结果显示在奶牛乳腺上皮细胞中，NR1H3与PPARγ存在相互作用。在12mM乙酸钠的作用下，NR1H3与PPARγ的相互作用增强。双分子荧光互补实验也观察到相同的结果。前期研究显示PPARγ可以结合AGPAT6启动子区(-110bp～+1bp)调节AGPAT6的转录。本研究通过双荧光素酶报告基因系统研究NR1H3对AGPAT6的转录调节，结果显示NR1H3基因干扰后，AGPAT6启动子(-110bp～+1bp)的启动活性显著下降(P＜0.05)。添加NR1H3激活剂T0901317处理可以显著提高AGPAT6的启动活性，表明NR1H3和PPARγ可以作用于AGPAT6启动子的同一区域。为进一步研究乙酸钠作用下，PPARγ是否与NR1H3协同调节AGPAT6转录，我们采用PPARγ激活剂Rosiglitazone作用细胞，同时干扰细胞中NR1H3的表达，结果显示Rosiglitazone作用会提高AGPAT6的转录活性,但干扰NR1H3后，Rosiglitazone对AGPAT6转录激活作用被抑制，这一结果进一步明确在乙酸作用下，NR1H3与PPARγ相互作用调节AGPAT6的表达，进而影响乳脂合成。 收起