摘要: 近年来，尽管人们在癌症生物学及抗癌治疗等方面作出了巨大努力，但癌症仍然是威胁人类健康的头号杀手。据最新报道显示，超过90％癌症死亡病例与肿瘤转移相关。在肿瘤转移过程中，肿瘤细胞能够从原发癌组织脱落进入患者外周血，形成循环肿瘤细胞（Ci... 展开 近年来，尽管人们在癌症生物学及抗癌治疗等方面作出了巨大努力，但癌症仍然是威胁人类健康的头号杀手。据最新报道显示，超过90％癌症死亡病例与肿瘤转移相关。在肿瘤转移过程中，肿瘤细胞能够从原发癌组织脱落进入患者外周血，形成循环肿瘤细胞（CirculatingTumorCells，CTCs）。CTCs的分离和分析对癌症患者的早期诊断和预后起着至关重要的作用，但其在外周血中数量极少且具有异质性，因此迫切需要开发可靠的CTCs检测和分离方法。CTCs的转移研究有助于揭示肿瘤转移机制，但传统动物模型实验周期长、建模困难，现有的体外二维和三维模型不能模拟肿瘤微环境，因此在体外构建仿生肿瘤转移模型，可为CTCs的转移研究提供有力平台。 随着微纳加工技术的发展，微流控技术已经被越来越多地应用于CTCs分选及分析。它将多个实验步骤集成于一个微米级芯片内，可实现进样、捕获、检测、释放及再培养等一体化操作，所需样品量少、灵敏度高。此外，微流控技术亦被应用于CTCs转移研究，以微流控芯片为基础的体外仿生肿瘤转移模型可模拟CTCs内渗、黏附、外渗、器官定向转移等多个步骤。 DNA纳米技术以核酸作为基础材料，可用于构建复杂多样的DNA纳米结构。与传统的纳米材料相比，其具备高生物相容性、易于多功能化修饰及纳米级寻址能力等优点。框架核酸作为一类典型的DNA纳米结构可修饰于微流控芯片基底，通过定价与定点分子修饰（如功能识别单元、荧光信号分子以及生物反应底物等）对识别分子精准排布，可有效提高生物分子信号转导。此外，框架核酸亦可用于细胞内生物成像，对肿瘤细胞转移过程中的标志性分子进行实时、动态观察。 本论文重点围绕构建微流控芯片并结合框架核酸开展CTCs分选及分析研究，同时利用微流控芯片联合框架核酸研究CTCs转移黏附过程。进一步地开发新型水凝胶材料用于构建微流控芯片。 论文开展了以下几方面研究: 1、构建光学微流控芯片结合框架核酸用于高效捕获和释放CTCs。在微流控芯片的醛基界面上共价结合氨基修饰的DNA四面体框架核酸自组主装分子，三维的四面体框架核酸分子提供刚性支撑和类溶液环境，通过与DNA探针杂交的方法结合带分支结构的杂交链式反应(HCR)，实现信号放大和多价捕获CTCs;微流控芯片上层附加鱼骨结构，可使液体产生涡流，增强基底DNA四面体框架核酸与CTCs的接触率，提高捕获效率。同时，利用全能核酸酶酶解DNA四面体框架核酸及HCR产物释放CTCs，所释放的CTCs无损，可再培养及进行下游分析。 2、构建电化学微流控芯片结合框架核酸用于高效检测和释放CTCs。利用双四面体框架核酸分子自下而上构建电化学生物传感平台，其中正置的四面体框架核酸分子作为刚性支架以Au-S键组装到丝网印刷金电极，倒置的四面体框架核酸分子提供三个顶点链与适配体多价结合，实现多价捕获CTCs。同时，链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶(SA-polyHRP)被连接到生物素修饰的核酸适配体上，以显著放大信号。该平台最低可检测1个CTC，释放效率高达97.6％。结合回形通道形成微流控芯片后，最快检测速度不到30min，有望在临床上实现即时检测。 3、构建多层结构的微流控芯片结合框架核酸用于研究CTCs黏附过程。该芯片上下两层为聚二甲基硅氧烷(PDMS)层，中间夹层为聚碳酸酯膜，通过氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)和O2等离子处理将PDMS和聚碳酸酯膜形成紧密封接。人脐带静脉血管内皮细胞(HUVECs)在上层通道内培养，模拟体内的血管内皮屏障。之前捕获并释放的CTCs以恒定流速通过上层通道中，模拟血液循环中的肿瘤细胞。不同浓度的趋化因子CXCL12置于下层培养池内，诱导CXCR4表达阳性的CTCs黏附于血管内皮屏障上，随着CXCL12浓度增加，黏附细胞数量显著增多。将四面体框架核酸与分子信标探针结合并首次引入至该微流控芯片中，标记CTCs转移过程中胞内标志性分子miRNA214，实现宏观细胞及微观分子的联合动态观察。 4、构建基于GelMA水凝胶的新型微流控芯片用于肿瘤细胞三维培养。GelMA是一种光敏型的水凝胶材料，与细胞外基质成分相似，能模拟真实的肿瘤微环境。为了改善GelMA水凝胶力学性能和物理性质，使其不仅满足细胞三维培养，同时保持构建微流控芯片的机械性能，采用丙烯酰化法将不同浓度的甲基丙烯酸酐(MA)与明胶反应，制备不同取代率的GelMA水凝胶。分别在最优配比的GelMA水凝胶双通道芯片内二维培养HUVECs细胞和三维培养MCF-7细胞，结果表明两种细胞能同时培养，且初步探究了血管内皮细胞与肿瘤组织间的相互作用。 收起