摘要: 粗毛纤孔菌（Inonotus hispidus）又叫做粗毛黄孔菌，是一种重要的药用真菌，主要分布于我国西北地区、华北地区和东北地区。三萜作为粗毛纤孔菌中重要的次级代谢产物，因其成分多样，结构复杂，具有多种功能而被受关注。但目前国内外对粗毛纤孔菌三萜... 展开 粗毛纤孔菌（Inonotus hispidus）又叫做粗毛黄孔菌，是一种重要的药用真菌，主要分布于我国西北地区、华北地区和东北地区。三萜作为粗毛纤孔菌中重要的次级代谢产物，因其成分多样，结构复杂，具有多种功能而被受关注。但目前国内外对粗毛纤孔菌三萜类化合物的研究主要集中在子实体，针对菌丝体的研究较少。因此，本试验以粗毛纤孔菌菌丝体为原料，首先优化其液体发酵培养基配方及添加MeJA与油酸复合诱导子，以最大程度提高三萜产量，然后研究三萜合成过程中对防御体系的影响，最后利用转录组学研究基因表达水平及确定差异表达基因，为揭示复合诱导子促进次生代谢物合成的积累奠定了一定的理论基础。得到的结果如下： （1） 本试验研究了碳氮源协同效应及MeJA与油酸复合诱导对粗毛纤孔菌菌丝体干重、三萜产量、菌丝形态的影响，以及对三萜类物质进行了定性分析。研究发现，粗毛纤孔菌液体发酵最佳培养基配方为：碳源为果糖40 g/L、氮源为牛肉膏6.2 g/L、碳氮比为20:1、磷酸二氢钾1 g/L，硫酸镁0.5 g/L。在此培养条件下，菌丝体干重和三萜含量均显著高于对照组（plt;0.05），分别为11.18 g/L，64.10 mg/g。加入MeJA/油酸复合诱导剂培养后粗毛纤孔菌菌丝体干重、三萜含量均显著高于对照组（plt;0.05），分别为14.83 g/L、157.46 mg/g。显微镜下观察发现，MeJA与油酸复配组菌丝最粗、排列紧密、长势最佳。在UPLC-TOF-MS联用条件下，通过与相关文献对比，初步推断粗毛纤孔菌三萜中含有贝萼皂苷元、积雪草酸、Abrisapogenol I、山楂酸、马斯里酸甲酯、熊果酸、齐墩果酸、齐墩果酸甲酯8 种三萜类化合物。 （2） 本试验通过测定粗毛纤孔菌培养液的pH值、电导率，菌丝体中过氧化氢、丙二醛、抗氧化物酶活性及三萜含量的变化，研究了MeJA与油酸复合诱导作用下菌丝体中防御酶变化与三萜类化合物合成量的相关性。试验结果发现与空白对照组相比，各试验组培养液的pH值、电导率值均显著增高（plt;0.05），其中复配组在第8 d pH值、电导率值均达到最高，此时菌丝体细胞膜的通透性最大，说明MeJA与油酸具有协同调节培养液pH值和电导率的作用。各试验组菌丝体中H2O2、丙二醛含量均显著低于对照组（plt;0.05），其中复配组在第8 d H2O2、MDA含量均达到最低值，说明MeJA与油酸具有协同降低H2O2、丙二醛含量的能力。各试验组菌丝体中SOD、CAT、POD活性及三萜含量均显著高于空白对照组（plt;0.05），其中复配组在第8 d菌丝体三萜含量增幅最大，说明在MeJA与油酸协同诱导作用下粗毛纤孔菌菌丝体发生了氧化应激反应，进而引起菌丝体发生防御性反应，最终提高了细胞内三萜类物质的合成量。 （3）本试验采用转录组测序技术对不同诱导条件下的粗毛纤孔菌进行转录组测序，对其转录组数据进行基因功能注释，获取萜类生物合成的关键酶，以及对差异表达基因进行分析，以研究MeJA与油酸协同诱导对粗毛纤孔菌三萜合成的诱导作用机制。研究发现，4 组粗毛纤孔菌悬浮培养菌丝体样品中共获得105.19 Gb Clean Data，各样品Clean Data均达到7.56 Gb，Q30碱基百分比在92.98%及以上。组装后共获得24306 条Unigene，其中长度在1 kb以上的Unigene有6981 条。有19429 条Unigene在各大公共数据库中分别得到功能注释，其中6537、6884及11968 个基因分别在KOG、GO及KEGG得到注释。通过对转录组数据挖掘发现，有49 条Unigenes参与萜类化合物骨架生物合成，且筛选出29 条Unigenes编码11 个参与萜类生物合成的关键酶。因此，本研究认为粗毛纤孔菌中三萜类物质可能主要是在菌丝体的细胞质中以MVA途径合成的。差异表达基因分析发现，空白与MeJA组、空白与油酸组、空白与复配组分别含有353、1078、893个差异基因。在被注释到防御体系中的CYP450差异表达基因聚类分析发现，空白与MeJA组、空白与油酸组、空白与复配组分别含有5、19、18 个差异基因。在本研究中可以推测，由于CYP450的上调促进了粗毛纤孔菌三萜类物质的合成，这将有助于揭示其在粗毛纤孔菌萜类合成路径中的调控作用机制。 收起