摘要: 目的：近年来，肿瘤热消融、免疫治疗等各种新兴的治疗手段被用于肿瘤的治疗中，也取得了令人瞩目的成绩。但临床上针对骨恶性肿瘤的治疗方式仍停留在手术、放化疗等传统方式上。本研究尝试以多巴胺修饰纳米金粒子，并通过多巴胺连接骨恶性肿瘤的常用... 展开 目的：近年来，肿瘤热消融、免疫治疗等各种新兴的治疗手段被用于肿瘤的治疗中，也取得了令人瞩目的成绩。但临床上针对骨恶性肿瘤的治疗方式仍停留在手术、放化疗等传统方式上。本研究尝试以多巴胺修饰纳米金粒子，并通过多巴胺连接骨恶性肿瘤的常用化疗药物阿霉素（DOX），用于治疗骨恶性肿瘤。多巴胺修饰的纳米金粒子具有良好的光热转化性能，在激光照射下可以实现对骨恶性肿瘤的光热治疗，其负载的DOX也可以对骨恶性肿瘤进行化疗。同时，纳米粒子负载后的DOX可以起到化疗药物增效减毒的作用。通过该纳米粒子我们尝试将新兴的光热治疗与化疗相结合起来，为骨恶性肿瘤新型治疗方式的探索提供参考。 方法：（1）负载DOX的多巴胺修饰的纳米金粒子的制备及表征：①首先以柠檬酸钠为还原剂，还原氯金酸，制得酒红色纳米金粒子（Au）；制备好的纳米金粒子分散在多巴胺的Tris-HCL缓冲液（pH为8.8），通过搅拌多巴胺自发的聚集在纳米金粒子表面，从而制得多巴胺修饰的纳米金粒子（Au@PDA）；将DOX溶解在的PBS缓冲液（pH为8.8）中，Au@PDA分散于其中，搅拌后DOX通过Michael加成反应和Schiff碱反应，与Au表面的多巴胺涂层连接，从而构建出Au@PDA@DOX。②制备好的纳米粒子，通过透射电镜（TEM）、纳米粒度仪表征其形貌、粒径及Zeta电位；并检测DOX的载药量、载药效率及其在不同pH的缓冲液中的释放情况。③采用热像仪考察制备的纳米粒子在近红外光照射下的光热转换能力；（2）负载DOX的多巴胺修饰的纳米金粒子的体外生物学性能评价：①我们制备出的Au、Au@PDA、Au@PDA@DOX与骨肉瘤细胞MG-63和小鼠前列腺癌细胞RM-1共培养，在体外观察纳米粒子对细胞生长情况的影响。分为6组：PBS对照组，游离DOX组，Au+NIR(808nm,1W/cm2的近红外激光)，Au@PDA+NIR，Au@PDA@DOX组和Au@PDA@DOX+NIR。通过CCK-8、活死细胞染色实验观察材料对的细胞增殖情况的影响；采用细胞划痕实验和Transwell实验考察各实验组对肿瘤细胞的迁移和侵袭的能力的影响。采用Tunel染色和Annexin-V-FITC/PI染色后分别用荧光显微镜和流式细胞术检测各实验组诱导肿瘤细胞凋亡的情况。②将小分子的DOX、Au@PDA@DOX与肿瘤细胞共培养，DAPI标记细胞核，在激光共聚焦显微镜下考察肿瘤细胞对DOX、Au@PDA@DOX的摄取；（3）负载DOX的多巴胺修饰的纳米金粒子的体内生物学性能评价：利用RM-1细胞构建前列腺癌的骨转移瘤模型，荷瘤小鼠分为六组：生理盐水对照组，游离DOX组，Au+NIR，Au@PDA+NIR，Au@PDA@DOX组和Au@PDA@DOX+NIR，每间隔一天记录小鼠体重及肿瘤变化情况，每间隔两天治疗一次并利用近红外热成像仪记录治疗温度情况。治疗12天后处死所有实验鼠，取小鼠肿瘤细胞制成单细胞悬液，检测肿瘤浸润淋巴细胞的激活情况，采集血液样本进行MCP-1和TNF-α等炎性指标检测，取小鼠心、肝、脾、肺和肾进行HE染色和ICP-OES检测观察主要脏器损伤情况和纳米材料在小鼠体内各器官蓄积情况，取出肿瘤进行称重并进行X线及PET-CT检查。 结果：（1）负载DOX的多巴胺修饰的纳米金粒子的制备及表征：①成功合成了Au、Au@PDA和Au@PDA@DOX。TEM显示所制备的各种纳米金粒子均为形貌大小均一的球形，多巴胺成功附着于纳米金粒子表面。动态光散射结果显示纳米粒子Au、Au@PDA的水合直径约为（14±2.0）nm和（70±3.0）nm，zeta电位为（-23±1.2）mV、（-26±1.1）mV，当DOX被成功负载到Au@PDA上后，纳米粒子的Zeta电位为（25±1.5）mV，水合粒径为（116.9±7）nm；②药物负载实验结果表明，随着DOX投入量的增加，载药量也持续增加，最高可达（12.8±0.8）%，Au@PDA@DOX药物释放具有pH敏感特性，在酸性环境中药物释放量明显大于生理条件；③所制备的纳米粒子具有良好的光热转化性能Au、Au@PDA和Au@PDA@DOX的光热转换率分别为(18±2.1)%、(42.5±1.1)%和(43.1±2.3)%，激光照射经过3次循环，光热转化性能没有显著减弱。在相同照射条件下，Au@PDA升温情况明显优于Au,表明PDA对Au的热转化起到了明显的协同作用。（2）负载DOX的多巴胺修饰的纳米金粒子的体外生物学性能评价：①所有的纳米粒子具有良好的生物相容性，与细胞共培养时在不光照的情况下，细胞的相对存活率保持在80%以上，未表现出明显细胞毒性。②光热与化疗协同治疗的结果表明，联合治疗对肿瘤细胞的抑制作用显著的优于单一的疗法，联合治疗下两种细胞系存活率均小于20%。这一结果与活死细胞染色实验结果一致，Au@PDA光照后在激光照射部位出现了大量死细胞，在Au@PDA@DOX组光照区域细胞甚至出现了细胞脱落的情况。③划痕和Transwell实验结果表明，与对照组相比，各实验组均能一定程度上抑制细胞迁移和侵袭，但Au@PDA@DOX+NIR组抑制效果明显强于其余各组（P＜0.05），且Au@PDA+NIR组抑制效果强于Au+NIR组（P＜0.05）。④细胞凋亡实验结果表明，Au@PDA@DOX+NIR组引起的细胞凋亡率明显高于其他组（P＜0.05）。⑤激光共聚焦和ICP-MS结果均表明纳米载药体系能够被肿瘤细胞摄取，负载在Au@PDA粒子表面的DOX比小分子的DOX表现出更多的摄取率，这表明Au@PDA@DOX对药物的负载，有效的提高了DOX的利用率。（3）负载DOX的多巴胺修饰的纳米金粒子的体内生物学性能评价：①我们成功的构建了胫骨的骨肿瘤转移瘤模型；②光热联合化疗的治疗模型有效的抑制了转移瘤在骨的生长和肿瘤对骨质的破坏和侵蚀。胫骨肿瘤最大周长测量及重量称量结构显示，Au@PDA@DOX+NIR组肿瘤最大周长和重量均小于其余五组（P＜0.05）；X线片和PET-CT三维重建图像可观察到，各组胫骨近端均有明显的骨质破坏和病理性骨折情况，但在Au@PDA@DOX+NIR组中，整体来说，胫骨是连续的，且胫骨形态相对规则完整，骨质破坏区域明显小于其他组，经计算Au@PDA@DOX+NIR组胫骨体积要大于其余五组，并具有统计学意义（P＜0.05）。③流式细胞仪检测肿瘤浸润淋巴细胞的变化，结果显示联合治疗组中肿瘤浸润CD8+T淋巴细胞比例显著高于其他各组（P＜0.05），这表明示联合治疗可能激活了机体的毒T淋巴细胞反应；联合治疗组血清中的肿瘤抑制因子TNF-α显著升高,也间接证实了这一点；此外，血清中炎性因子MCP-1显著降低，这表明肿瘤生长受到限制。④ICP-OES结果表明，纳米粒子在肝脏中有一定比例的蓄积，另外在脾和肺中有少量检出，在心和肾中未检出，这表明纳米金粒子在体内可能通过肝脏代谢。治疗结束后，各组心、肝、脾、肺和肾HE染色结果显示，各主要脏器未见明显的结构改变和炎性损失。这表明纳米粒子未对主要脏器产生实质性的影响，具有较好的生物安全性。 结论：本研究通过简单的方式成功的将DOX负载到多巴胺修饰后的纳米金粒子表面。该纳米粒子呈有一致的球形，负载DOX以后，可以有效的被肿瘤细胞摄取，提高了化疗药物DOX的利用率。同时，该纳米粒子具有pH敏感性能，在肿瘤的微酸环境下DOX的释放更加显著。因此，Au@PDA是一种理想的肿瘤药物载体。多巴胺修饰后的纳米金粒子，有效的改善了纳米金粒子的生物相容性和光热转化性能，Au@PDA@DOX纳米粒子也是一种有效的光热治疗的光敏剂。Au@PDA@DOX纳米粒子同时将化疗、光热治疗联合起来，表现出了优异的抗肿瘤性能，可以有效的抑制骨转移瘤的生长、对骨质的侵蚀和破坏。光热治疗进一步的激活了机体的免疫系统，从而发挥更强大的抗肿瘤效果。因此，该纳米粒子对肿瘤具有三重的抑制作用，包括化疗、光热治疗和免疫治疗，为骨肿瘤的治疗提供了一种新的治疗思路。 收起