摘要: 黄酮化合物生物合成过程复杂，越来越多的研究表明转录因子在黄酮化合物合成过程中起着决定性的作用。其中MYB转录因子在调控网络中处于核心地位，如以MYB转录因子为核心的MBW转录复合体参与了花青素、原花青素等合成过程的调节。在拟南芥中，人们鉴定... 展开 黄酮化合物生物合成过程复杂，越来越多的研究表明转录因子在黄酮化合物合成过程中起着决定性的作用。其中MYB转录因子在调控网络中处于核心地位，如以MYB转录因子为核心的MBW转录复合体参与了花青素、原花青素等合成过程的调节。在拟南芥中，人们鉴定了很多参与黄酮化合物代谢的MYB转录因子，其机理研究的也较为透彻。但是在豆科植物中，黄酮化合物转录调控研究才刚刚起步，克隆的转录因子有限，调控机理也是一直未知。Verdier等人在豆科模式植物-蒺藜苜蓿中发现了一个MYB转录因子MtPAR，其突变体种子具有很明显的原花青素缺陷表型，这说明MtPAR是种子中PA合成所必须的因子，被称为PA合成开关，但是其具体调控机理一直未知，这严重影响了MtPAR在其它植物上的应用。大豆富含异黄酮、花青素和原花青素等黄酮化合物，但是由于突变体的缺乏，在黄酮化合物合成调控方面研究更为缓慢，目前为止还未见对大豆黄酮代谢调控系统性研究的报道。基于这两点，本课题主要集中在以下两个方面：1MtPAR调控原花青素机理研究： (1)MtPAR调控原花青素机理研究。超表达MtPAR的蒺藜苜蓿发根与对照相比，原花青素含量显著升高，而异黄酮含量显著降低，花青素含量则变化不大。分别对这些黄酮化合物合成途径基因的表达分析也发现相对应的变化趋势。为了了解MtPAR影响异黄酮合成的普遍性和作用机理，我们又把MtPAR超表达在大豆发根中，也同样发现异黄酮含量、异黄酮合成相关基因都比对照显著降低。通过酵母单杂交实验，证实了MtPAR能结合到IFS2基因的启动子区而抑制其表达，最终造成异黄酮合成受阻。转基因拟南芥研究发现MtPAR能互补attt2种子的原花青素缺陷表型，而过表达野生型种子原花青素含量提高了22%，这些结果说明MtPAR与AtTT2具有相似的功能。进一步研究发现，MtPAR能与具有调控花青素和原花青素合成的bHLH转录因子MtTT8和WD40重复蛋白MtWD40-1分别互作，共同激活MtANR启动子。MtPAR调控原花青素机理可以概括为MtPAR通过与MtTT8和MtWD40-1互作形成MBW复合体激活ANR基因的表达；另一方面，MtPAR还可结合到IFS2基因的启动子区抑制异黄酮合成相关基因表达，使更多的前体物质进入原花青素合成途径。 (2)MtPAR在紫花苜蓿原花青素遗传改良中的应用。研究表明，在优质牧草紫花苜蓿茎叶中添加足量的原花青素能够抑制反刍动物如牛和羊等食用紫花苜蓿后的胀气致死。牛羊因食用紫花苜蓿导致的胀气致死导致每年数百万美元的损失。我们上述研究揭示了MtPAR调控原花青素合成的代谢流双重调控机理。在表达MtPAR的基础上，又将花青素特异性调控因子MtLAP1基因引入到紫花苜蓿中来增强花青素合成的强度。通过在紫花苜蓿中共表达MtPAR和MtLAP1，我们在其地上部分检测到了含量可观的原花青素积累，而对照含量几乎为零，这为培育抗牛羊胀气致死的新苜蓿品种奠定了基础。 2大豆黄酮代谢调控机理研究： 通过对黄色种皮大豆、黑色种皮大豆和棕色种皮大豆的不同发育时期种子花青素和原花青素的含量变化趋势，结合GmANS和GmANR的表达变化趋势，我们发现了一个与花青素和原花青素合成密切相关的MYB转录因子GmMYB115。GmMYB115是MtPAR的同源蛋白，也能部分互补attt2突变体种子原花青素缺陷表型，超表达野生型拟南芥种子原花青素含量升高，并且能替代AtTT2而与AtTT8和AtTTG1形成MBW三元复合体。超表达GmMYB115的早花烟草的花瓣颜色由浅色变为深红色，这说明GmMYB115可促进花青素的积累，对相关基因的分析发现ANS、ANR等基因表达量升高。进一步研究表明，GmMYB115能与GmTT8和GmTTG1互作，形成三元复合体，一起激活GmANS和GmANR启动子。超表达GmMYB115的大豆发根中虽然没有花青素和原花青素的积累，却检测到GmANS、GmLAR和GmANR等基因的明显上调表达。同样我们也观察到GmMYB115转基因发根异黄酮含量显著下降，与之相伴随的是异黄酮合成途径催化酶的系列编码基因被下调。进一步分析发现，GmMYB115也能结合到IFS2基因的启动子区，抑制IFS2基因的表达。与MtPAR相似，我们推测GmMYB115抑制IFS2等基因表达很可能是由于GmMYB115占据了其它正调控MYB转录因子的结合位点。RNA-seq结果表明过表达GmMYB115显著改变了一些下游抑制子和激活子基因的表达，而这些下游转录因子很可能介导GmMYB15调控IFS等异黄酮合成基因表达。因此未来我们将进一步分析这10下游抑制子和激活子基因的功能，进一步解析GmMYB115或MtPAR抑制异黄酮合成的机理。 收起