摘要: 本文主要从以下几部分进行论述： 第一部分 氟/硅离子改性纳米羟基磷灰石的合成及其物理化学性质 目的：合成纳米羟基磷灰石（Hydroxyapatite nanoparticles，nHA），纳米氟羟基磷灰石（Fluoridated Hydroxyapatite nanoparticles，nFHA）和纳米... 展开 本文主要从以下几部分进行论述： 第一部分 氟/硅离子改性纳米羟基磷灰石的合成及其物理化学性质 目的：合成纳米羟基磷灰石（Hydroxyapatite nanoparticles，nHA），纳米氟羟基磷灰石（Fluoridated Hydroxyapatite nanoparticles，nFHA）和纳米硅羟基磷灰石（Silicon Substitute Hydroxyapatite nanoparticles，nSiHA）并检测三种材料的物理化学特征。 材料和方法：使用硝酸钙（Calcium Nitrate，Ca(NO3)2）作为钙（Ca）源，磷酸氢二氨（Ammonium Dihydrogen Phosphate，(NH4)2HPO4）作为磷（P）源，氟化铵（Ammonium Fluoride，NH4F）作为氟（F）源，正硅酸乙酯（Tetraethoxysilane，TESO）作为硅（Si）源，采用沉淀法，分别制备nHA，nFHA和nSiHA。扫描电镜（Scanning Electron Microscope，SEM）观察材料表面形态。透射电镜（Transmission Electron Microscope，TEM）观察材料内部形态。X射线衍射（X-Ray Diffraction，XRD）检测内部孔隙和晶格结构。X射线电子能谱分析（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）确认nHA，nFHA和nSiHA的化学组分。 结果：SEM和TEM显示nHA为长约100nm，直径约为20nm的棒状结构。nFHA为长约600nm，直径约100nm的棒状结构。nSiHA为长约400nm，直径约为50nm的棒状结构。XRD分析显示所合成的nHA衍射峰为标准的HA衍射峰。nFHA中随F的引入，结晶度相对nHA提高。nSiHA随着Si引入后，结晶度相对HA降低。XPS结果显示HA组成元素有Ca、O、P，其中Ca:P=1.66；FHA的组成元素有Ca、O、P、F，其中F：OH=1.1:0.9；SiHA的组成元素有Ca、O、P、Si，其中Siwt%=0.77%。 结论：nFHA和nSiHA成功合成。 第二部分 氟/硅离子改性纳米羟基磷灰石对成骨影响的体内外对比研究 实验一 氟/硅离子改性纳米羟基磷灰石对成骨影响的体外对比研究 目的：提取大鼠骨髓间充质干细胞（Bone Marrow Mesenchyml Stem Cells，BMSCs）并进行鉴定，对比研究nHA、nFHA和nSiHA三种材料在体外成骨分化能力的差异。 材料与方法：提取，培养并通过茜素红染色，油红染色和阿尔辛蓝染色及流式细胞检测鉴定SD大鼠（Sprague-daw Rats）BMSCs的三向分化和表面蛋白表达。使用氟离子分析仪和等离子发射光谱测定nFHA和nSiHA浸提液中氟离子（F-）和硅酸根离子（SiO44-）释放浓度。10μg/mL，2.5μg/mL，0.625μg/mL的nHA、nFHA和nSiHA浸提液处理BMSCs，四甲基偶氮唑盐比色法（MTT method，MTT法）检测三种纳米材料浸提液的细胞毒性，确定最佳浸提液浓度。细胞荧光染色检测BMSCs在nHA、nFHA和nSiHA浸提液中培养时1、4、7天时的细胞形态及粘附。茜素红染色、碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，ALP)活性定量分析探究nHA、nFHA和nSiHA浸提液对BMSCs的成骨分化水平的影响。 结果：骨髓冲洗法提取的BMSCs具有成骨向、成脂向和成软骨向三向分化能力。细胞流式检测原代BMSCs细胞表面特征分子蛋白CD44和CD29表达gt;80%，CD45和CD11b表达lt;10%。nHA，nFHA和nSiHA浸提液对BMSCs均无细胞毒性，且0.625μg/mL浓度下三种纳米材料浸提液均可以促进细胞增殖。BMSCs在0.625μg/mL的nHA和nSiHA浸提液中生长形态良好，在0.625μg/mL的nFHA浸提液中培养至第7天起形态发生皱缩。 结论：成功提取SD大鼠骨髓间充质干细胞；nFHA在体外具有最佳的促成骨性能，F/Si改性nHA和nHA体外促成骨能力的排序：nFHAgt;nSiHAgt;nHAgt;空白组。 实验二 氟/硅离子改性纳米羟基磷灰石对成骨影响的体内对比研究 目的：对比研究nHA，nFHA和nSiHA在SD大鼠体内股骨干骺端骨缺损模型中对成骨的影响。 材料和方法：构建SD大鼠股骨干骺端骨缺损模型，分别植入nHA、nFHA和nSiHA。显微CT(Micro-computed Tommography，μCT)定量分析nHA，nFHA和nSiHA植入修复大鼠股骨头骨缺损区的骨体积分数（Bone Volume Fraction，BV/TV），骨小梁宽度（Trabecula Bone Thickness，Tb.Th），骨表面体积比（Bonesurface/Bone volume，BS/BV），骨小梁间隙（Trabecular Space，Tb.Sp）和骨小梁数目（Trabecula Bone Number，Tb.N）的差异。 结果：μCT和Hamp;E染色结果显示各组在骨缺损修复4周和8周观察到的新骨形成差异较大，术后8周，nSiHA组骨缺损区愈合情况最佳。TRAP染色显示，与nHA组相比，nSiHA组的破骨细胞多，而nFHA组和Blank组破骨细胞较少。 结论：在大鼠体内骨缺损区，nSiHA具有最佳的促进成骨的能力，三种纳米材料在体内促成骨作用排序：nSiHAgt;nFHA和nHAgt;空白组。 第三部分 氟/硅离子改性纳米羟基磷灰石对牙龈卟啉单胞菌的抗菌性能对比研究 目的：对比研究nHA，nFHA和nSiHA在对抑制牙龈卟啉单胞菌性能差异。 材料和方法：将nHA，nFHA和nSiHA制成直径6mm的圆片状。将P.gingivalis与nHA，nFHA和nSiHA圆片材料共培养，通过细菌平板涂布定量分析三种纳米材料对P.gingivalis的抗菌性能。通过活死菌染色观察三种纳米材料对P.g的抗菌性能。 结果：P.gingivalis与nHA，nFHA和nSiHA圆片材料共培养后，细菌涂布所得的单克隆菌落计数显示P.gingivalis与nFHA圆片材料共培养的细菌计数显著少于nSiHA和nHA片剂。活死菌染色显示，nHA和nSiHA圆片材料上的活菌与死菌含量均高于nFHA片剂组。 结论：nFHA相对于nHA和nSiHA，具有最强的抗菌能力。 第四部分 氟离子改性纳米羟基磷灰石对牙龈卟啉单胞菌脂多糖刺激的MC3T3-E1细胞炎症因子表达及成骨分化的影响 目的：使用P.gingivalis脂多糖（Lopopolysaccharid，LPS）刺激MC3T3-E1细胞，构建MC3T3-E1细胞的体外炎症模型，探究nFHA对MC3T3-E1体外炎症模型中相关细胞炎症因子mRNA表达水平及成骨矿化水平的影响。 材料与方法：RT-PCR检测1μg/mL、5μg/mL和10μg/mL P.gingivalis LPS刺激MC3T3-E1细胞6、12、24小时后炎症相关因子：白细胞介素-6、白细胞介素-1β和肿瘤坏死因子α的mRNA表达水平，筛选出构建MC3T3-E1体外炎症模型的最佳P.gingivalis LPS浓度及相应刺激时间。细胞计数CCK-8试剂盒（Cell Count Kit-8，CCK8）检测最佳浓度的P.gingivalis LPS对MC3T3-E1的细胞毒性作用。RT-PCR检测0.5μg/mL、1μg/mL和5μg/mL nFHA浸提液对MC3T3-E1体外炎症模型中IL-6、IL-1β和TNF-α的表达调控作用。 结果：RT-PCR结果显示5μg/mL P.gingivalis LPS刺激MC3T3-E112小时，可以显著诱导IL-6，IL-1β和TNF-α的mRNA的表达，且5μg/mL的P.gingivalis LPS对细胞无毒性。RT-PCR结果显示低浓度（lt;1μg/mL）nFHA浸提液显著降低MC3T3-E1体外炎症模型中IL-6，IL-1β和TNF-α炎症因子mRNA的表达水平。高浓度nFHA浸提液（5μg/mL），刺激MC3T3-E1炎症模型24小时后，炎症因子表达反而增高。RT-PCR结果显示：连续成骨诱导7、14、21天，1μg/mL nFHA浸提液可以显著提高MC3T3-E1体外炎症模型中成骨相关基因Alp、Runx2、Ocn、Opn、Vegf和Osx的mRNA表达水平，但仍低于对照组中正常细胞的表达水平。茜素红染色及ALP染色结果显示与RT-PCR一致：1μg/mL nFHA浸提液能显著改善体外炎症环境中MC3T3-E1的成骨分化水平。 结论：5μg/mL P.gingivalis LPS刺激MC3T3-E112小时，可成功构建体外MC3T3-E1炎症模型。低浓度（1μg/mL）nFHA浸提液显著降低MC3T3-E1炎症模型中IL-6，IL-1β和TNF-α炎症因子mRNA的表达水平。1μg/mL nFHA浸提液可能通过抑制MC3T3-E1炎症因子的表达从而显著改善体外炎症环境中MC3T3-E1的成骨分化水平。 收起