摘要: 致病菌、病毒核酸、肿瘤相关标志物等生物分子的检测对于疾病类型的确定、相关治疗监测等具有重要的指导意义，因此发展可靠、灵敏、快捷的高通量检测方法成为相关技术发展的一种趋势。基于上转换发光的光学传感方法在生物分子检测方面拥有独特的优势... 展开 致病菌、病毒核酸、肿瘤相关标志物等生物分子的检测对于疾病类型的确定、相关治疗监测等具有重要的指导意义，因此发展可靠、灵敏、快捷的高通量检测方法成为相关技术发展的一种趋势。基于上转换发光的光学传感方法在生物分子检测方面拥有独特的优势，如背景荧光低、粒径可调、多色发射等。然而实验室常用的荧光成像系统和流式细胞仪等流体检测工具往往均没有配置近红外激发光源，因此限制了上转换发光光学传感策略与成像技术或微流体检测方法相结合用于生物分子检测应用的开展。 本论文基于实验室已构建的光镊成像分析平台和微流控流式检测平台，合成不同结构的UCNPs，同时结合发光共振能量转移(LRET)效应、DNA分子机器、间接免疫荧光标记等传感策略，构建不同生物分子的分析检测方法。本论文的主要内容如下： (1)构建了一种新颖的分析策略，即将上转换LRET效应、光镊技术和“DNAwalking”放大策略同时应用于基于微球的成像分析检测中，并将其应用于检测乳腺癌潜在肿瘤标志物—miRNA-21序列。具体来说，首先制备了“三明治”结构的UCNPs(SUCNPs)，通过配体交换法对其水溶性修饰聚丙烯酸分子。将SUCNPs与氨基修饰的硅球(ASBs)偶联后，将DNAWalker链和DNA底物链共价偶联到硅球表面SUCNPs上。在检测目标miRNA序列之前，通过引入一条锁链DNA分子锁定DNA步行行为，同时基于LRET效应通过能量受体(BHQ-1)猝灭硅球表面上转换发光。加入miRNA-21序列后，DNAWalker链由于链置换机理而被释放。最后，DNA步行行为由nicking核酸内切酶驱动，通过配置了EMCCD的光镊平台光学捕获芯片小室中的单个目标硅球，测定其恢复发光信号的灰度值，实现miRNA-21序列的定量检测。该检测方法具有超高灵敏度，检出限低至69aM，线性检测范围为100aM-3pM，并具有检测单碱基错配序列的良好选择性。此外，这种分析策略可以检测低至5个MCF-7细胞中的miRNA-21序列，有望实现在单细胞水平上检测低丰度的目标miRNA序列，并且对血清试样和乳腺癌病人静脉血样本中miRNA-21的含量进行了准确定量检测，显示出良好的临床检测应用前景。 (2)利用实验室构建的微流控流式平台，将上转换发光标记和流体聚焦策略相结合，应用于大肠杆菌O157:H7(E.coli O157:H7)的检测。具体来说，首先通过热分解法制备了油酸包覆的Yb3+，Er3+共掺杂的NaYF4上转换纳米粒子，通过配体交换法对其水溶性修饰上聚丙烯酸分子。通过酰胺化反应将金葡菌蛋白A(SPA)共价偶联于上转换纳米粒子表面作为荧光标记探针。在E.coliO157:H7多克隆抗体识别目标菌后，通过上转换纳米粒子表面偶联的SPA和上述多抗结合，实现目标菌的发光标记。通过芯片中微流体聚焦目标菌，利用配置980nm激发光源的微流控流式检测平台获取目标菌的发光信号，并由自制的软件记录。采用本流式分析方法实现了E.coliO157:H7的初步检测。 收起