摘要: 冰葡萄酒(Icewine)是葡萄酒家族中的极品，具有口感润滑、甜美醇厚、香气浓郁等特点。酿制冰葡萄酒的原料—冰葡萄，其生长对气候环境和纬度有严格要求，世界上仅有加拿大、德国、奥地利、中国等少数国家能够生产冰葡萄酒。目前，世界公认的酿造冰葡萄... 展开 冰葡萄酒(Icewine)是葡萄酒家族中的极品，具有口感润滑、甜美醇厚、香气浓郁等特点。酿制冰葡萄酒的原料—冰葡萄，其生长对气候环境和纬度有严格要求，世界上仅有加拿大、德国、奥地利、中国等少数国家能够生产冰葡萄酒。目前，世界公认的酿造冰葡萄酒的主要栽培品种为威代尔葡萄。由于冰葡萄汁中较高可溶性固形物形成的高渗透压环境，一般酵母菌难以正常生长、繁殖和发酵。目前中国冰葡萄酒生产企业大都从国外进口冰葡萄酒酿造用酵母，未能在冰葡萄酒酿造中形成自有菌株的核心技术，这严重制约着中国冰葡萄酒产业发展和产品品质提升。 本研究以辽宁五女山米兰酒业有限公司（简称:五女山样品）和沈阳太阳谷庄园葡萄酒有限公司（简称:太阳谷样品）两个产地的威代尔冰葡萄为实验材料，利用传统形态学鉴定和高通量测序技术研究冰葡萄酒发酵过程中酵母菌多样性，阐明酵母菌群落的演替规律。通过对酵母菌株的耐受性能、发酵性能及β-葡萄糖苷酶活力等研究，筛选优良酵母菌株，并进一步对其发酵特性进行研究。本研究挖掘和利用具有潜在功能的天然微生物资源，筛选性能优良的适应本地环境及生产条件的野生酵母菌株，可为中国的冰葡萄酒酿造用酵母国产化奠定理论基础和技术支撑，为酿造具有本地特色的冰葡萄酒提供一定理论依据。取得的主要研究结果如下: 1、利用形态学鉴定方法揭示了辽宁产威代尔冰葡萄酒自然发酵过程中酵母菌多样性及菌群动态变化。该方法利用WL营养琼脂培养基培养与5.8S rDNA-ITS区和26S rDNA D1/D2区测序相结合对酵母菌多样性进行了鉴定。(1)五女山样品共检出13个属:短梗霉属(Aureobasidium)，假丝酵母属（Candida），隐球酵母属（Cryptococcus），Curvibasidium(无中文名)，德巴利酵母属（Debaryomyces），汉逊酵母属（Hanseniaspora），梅奇酵母属（Metschnikowia），红酵母属（Rhodotorula），掷孢酵母属（Sporobolomyces），酿酒酵母属（Saccharomyces），孢圆酵母属（Torulaspora），接合酵母属（Zygosaccharomyces）和Zygotorulaspora（无中文名）。(2)太阳谷样品共检出12个属:短梗霉属，假丝酵母属，隐球酵母属，线黑粉酵母属（Filobasidium），汉逊酵母属，毕赤酵母属(Pichia)，红酵母属，酿酒酵母属，锁掷酵母属（Sporidiobolus），孢圆酵母属，接合酵母属和接合囊酵母属（Zygoascus）。(3)优势酵母菌群动态变化:①五女山样品，初期:以假丝酵母属、汉逊酵母属、梅奇酵母属、红酵母属占优势;中期:假丝酵母属、梅奇酵母属和酿酒酵母属占优势;后期:酿酒酵母属占优势;②太阳谷样品:初期:以假丝酵母属、隐球酵母属、线黑粉酵母属占优势;中期:以假丝酵母属、毕赤酵母属和酿酒酵母属占优势;后期:假丝酵母属和酿酒酵母属占优势。 2、利用高通量测序(HTS)方法揭示了辽宁产威代尔冰葡萄酒自然发酵过程中酵母菌多样性及菌群动态变化。(1)五女山样品中真菌共检出68个属:葡萄酒酵母有假丝酵母属、梅奇酵母属、酿酒酵母属等12个属，及短梗霉属、Mrakiella和Mrakia等真菌。(2)太阳谷样品中真菌共检出36个属:葡萄酒酵母有假丝酵母属、隐球酵母属、酿酒酵母属等8个属，及短梗霉属、Alternaria、Davidiella等真菌。(3)优势酵母菌群动态变化:①五女山样品:初期:隐球酵母属和红酵母属占优势;中期:假丝酵母属、隐球酵母属和红酵母属占优势;后期:梅奇酵母属和酿酒酵母属占优势。②太阳谷样品:初期:隐球酵母属和线黑粉酵母属占优势;中期:假丝酵母属和酿酒酵母属占优势;后期:假丝酵母属和酿酒酵母属占优势。 3、解明了冰葡萄酒发酵过程中酵母菌群落演替规律。酵母菌群落的演替与冰葡萄汁中糖的消耗及酒精的产生直接相关。在初期，耐高糖的非酿酒酵母占优势;中期，耐酒精能力差的非酿酒酵母逐渐消失，耐酒精能力强的酿酒酵母逐渐占优势;后期，耐酒精能力强的酿酒酵母及少数非酿酒酵母属种占优势。 4、明确了分离得到的葡萄酒酵母假丝酵母属、梅奇酵母属、酿酒酵母属等7个属菌株对高糖浓度、酒精浓度、酸浓度及抑菌剂SO2的耐受能力。通过酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae菌株发酵性能研究，筛选得到了1株发酵速度快、挥发酸产量低的S.cerevisiae菌株。同时，假丝酵母属、汉逊酵母属等6个属菌株的β-葡萄糖苷酶活力研究发现，假丝酵母属的1株Candida railenensis的β-葡萄糖苷酶活力最高。 5、将筛选获得假丝酵母属的C.railenensis菌株与S.cerevisiae菌株进行混合发酵(MF2S2)、S.cerevisiae单菌株发酵(S2)制备冰葡萄酒。利用代谢组学研究方法非靶向顶空固相微萃取气相色谱-飞行时间质谱联用技术(HS-SPME-GC-TOFMS)对发酵结束后的冰葡萄酒的代谢产物进行分析:总共检出600种代谢物，其中MF2S2与S2两组之间差异代谢物共248种，又从中筛选出与冰葡萄酒香气有关的重要代谢物53种。两组冰葡萄酒的香气物质呈现出明显差异:苯甲醛、乙偶姻、β-大马士酮等13种物质在MF2S2冰葡萄酒中的相对含量明显高于其在S2中的含量，而1-丁醇、乙酸乙酯等40种物质则正相反。利用PEN3型电子鼻及感官分析两组冰葡萄酒的香气，结果显示:MF2S2冰葡萄酒的香气物质比S2的更丰富;MF2S2比S2香气及口感更浓郁，主要表现在烘烤焦糖和干果果仁的香气，S2比MF2S2在热带水果的香气要浓郁。 本研究筛选获得的C.railenensis和S.cerevisiae本地酵母菌株，具有较好的耐受性能和发酵性能，有望成为本地冰葡萄酒酿造用酵母菌株。 收起