摘要: 研究背景： 重度抑郁症(major depressive disorder, MDD)是一种遗传和环境因素共同作用所导致的严重精神疾病，具有高致残性。然而，现有常规药物治疗对约三分之一的MDD患者无效。因此进一步阐明MDD的病理过程，探索新的防治策略已显得迫在眉睫。... 展开 研究背景： 重度抑郁症(major depressive disorder, MDD)是一种遗传和环境因素共同作用所导致的严重精神疾病，具有高致残性。然而，现有常规药物治疗对约三分之一的MDD患者无效。因此进一步阐明MDD的病理过程，探索新的防治策略已显得迫在眉睫。MDD的病理机制复杂，与长期的社会、心理应激有关。研究表明，不同类型的心理及社会应激可诱导中枢促炎细胞因子表达，而NLRP3炎症小体是介导应激和神经免疫反应的桥梁。自噬是细胞对抗恶劣环境和应激条件的适应性反应，与内稳态的维持和恢复密切相关，在宿主防御系统和机体免疫调节过程中发挥着重要作用。功能正常的自噬系统可防止NLRP3炎症小体的过度激活及IL-1β等促炎细胞因子的过度生成。有意思的是，研究发现不同于社会挫败应激(social defeat stress，SDS)等经典应激MDD动物模型，长期给予大鼠可预见性温和应激(predictablechronicmild stress,PCMS)可显著改善大鼠的情绪、学习和记忆能力，表现出潜在的抗抑郁作用。表明与长期、高强度应激诱发病理反应不同，轻度、可耐受的应激反而有一定的神经保护作用。因此，基于以上研究证据，我们提出应激预适应假说，即机体在轻度、可耐受的应激过程中也在适应着应激环境，从而增加机体对随后持续应激的抵抗能力和耐受性。 研究目的： 1.考察各组动物行为学表现，以确证应激预适应假说；考察各组小鼠海马小胶质细胞极化表型(M1/M2)标记分子表达差异，探索PCMS的神经免疫调控作用。 2.利用LPS诱导炎症相关MDD模型，验证PCMS的抗抑郁作用与调节神经炎症反应及炎症小体激活的直接联系。 3.考察PCMS及SDS对海马自噬功能的影响，并明确PCMS的抗抑郁作用是否与对自噬过程的调节有关，并进一步考察PCMS是否经由自噬调节NLRP3炎症小体激活。 4.高通量测序分析PCMS及SDS模型小鼠海马miRNA表达谱差异，并进一步探讨miR-210-3p在应激抵抗及细胞自噬、神经炎症反应中作用。 研究方法： 1.预先建立PCMS应激预适应小鼠模型，并随后给予SDS进行MDD造模，考察各组(对照组，PCMS组，SDS组，PCMS+SDS组)小鼠在旷场实验(openfieldtest, OFT)、高架十字迷宫(elevatedplusmaze,EPM)、社交行为实验(socialinteraction test，SI)及强迫游泳实验(forced swim test, FST)中的行为学表现。 2.利用Iba-1免疫荧光标记活化的小胶质细胞；real-timePCR检测以上各组海马M1标志分子IL-1β、IL-6、TNF-α、iNOS及M2标记分子Arginase1、IL-4、IL-10、Ym-1基因表达；BrdU免疫荧光检测海马DG区神经细胞增殖；westernblot测定海马pro-BDNF和m-BDNF蛋白表达变化；酶联免疫试剂盒测定小鼠血中皮质酮含量。 3.预先建立PCMS应激预适应模型，随后腹腔注射LPS诱导炎症相关MDD模型，进一步确证PCMS的神经免疫调节作用。考察各组小鼠在OFT、EPM、FST中的行为学表现；Iba-1免疫荧光标记活化的小胶质细胞；real-timePCR及westernblot检测各组海马炎性细胞因子IL-1β，IL-6、TNF-α的mRNA表达及NLRP3炎症小体组成蛋白表达。 4.Real-timePCR及westernblot测定海马自噬相关蛋白LC3、p62、Beclin-1、ATG5、ATG7及ATG12mRNA及蛋白表达变化；应用自噬双标腺病毒(mRFP-GFP-LC3)及溶酶体抑制剂氯喹，考察PCMS及SDS对海马自噬流的影响。 5.应用自噬抑制剂3-MA，考察抑制自噬对PCMS抗抑郁作用的影响，westernblot测定NLRP3炎症小体组成蛋白表达变化，验证PCMS是否经由自噬发挥神经免疫调控及抗抑郁作用。 6.高通量测序分析PCMS及SDS小鼠海马miRNAs表达谱差异，并利用real-timePCR验证差异miRNAs，筛选出与自噬、免疫调节密切相关的差异miRNA；利用慢病毒载体分别过表达及抑制筛选出的miR-210-3p，考察行为学验证miR-210-3p在应激敏感性/抵抗性中的作用。 7.构建Atg73’UTR野生型和突变型载体，利用双荧光素酶报告系统验证miR-210-3p对Atg7的调控作用；利用LPS诱导BV2小胶质细胞激活，通过细胞瞬时转染上调/下调miR-210-3p表达，确证miR-210-3p在细胞自噬、NLRP3炎症小体激活及神经炎症反应中的作用。 研究结果： 1.相比对照组，SDS诱导了小鼠抑郁样行为，引起小胶质细胞M1型标志物表达上调、M2型标志物表达下调；PCMS本身降低了小鼠在FST中的不动时间、促进海马神经细胞增殖；PCMS缓解了SDS诱导的抑郁样行为，并抑制了SDS诱导的海马小胶质M1型极化。 2.相比对照组，LPS显著诱导了小鼠抑郁样行为及神经炎症反应，而PCMS缓解了LPS诱导的抑郁样行为，并抑制了LPS引起的神经炎症反应及NLRP3炎症小体激活。 3.相比对照组，SDS抑制了海马自噬；PCMS则增强了海马自噬流，改善了SDS引起的海马自噬障碍。 4.3-MA阻断自噬则消除了PCMS对SDS的应激抵抗作用。 5.相比对照组，SDS显著诱导了NLRP3组成蛋白及成熟IL-1β表达，PCMS则抑制SDS引起的NLRP3炎症小体激活；3-MA阻断自噬消除了PCMS对NLRP3炎症小体的抑制作用。 6.高通量测序结果表明PCMS和SDS小鼠海马miRNAs表达谱存在明显差异；进一步验证发现，相比对照组，SDS诱导了海马miR-210-3p表达，而PCMS则抑制了miR-210-3p表达；脑内过表达miR-210-3p的小鼠对急性应激的抵抗能力降低，而抑制小鼠脑内miR-210-3p表达改善了SDS诱导的抑郁样行为，并缓解了SDS引起的自噬抑制作用。 7.双荧光素酶报告实验发现，相比Atg73’UTR突变型载体，miR-210-3p模拟物与野生型载体共转染后荧光值显著下降；BV2细胞转染miR-210-3p模拟物后ATG7蛋白表达水平下调，而转染抑制物则ATG7蛋白表达上调。 8.LPS诱导了BV2细胞miR-210-3p表达，并抑制了LC3-II及ATG7蛋白表达，而抑制miR-210-3p表达物则逆转了LPS对自噬的抑制作用，并缓解LPS诱导的NLRP3炎症小体激活。 结论： 1.PCMS应激预适应增强了小鼠对之后SDS的应激抵抗，改善了SDS诱导的抑郁样行为；同时PCMS抑制了海马小胶质细胞M1极化，缓解了SDS诱导的促/抗炎细胞因子失衡。 2.PCMS通过抑制NLRP3炎症小体的过度激活，缓解神经炎症反应及氧化应激损伤，改善了LPS免疫应激诱导的抑郁样行为。 3.维持正常功能的自噬过程对于PCMS增强应激抵抗及神经免疫调控作用至关重要。PCMS通过恢复自噬功能，经由自噬抑制SDS诱导的NLRP3炎症小体激活及下游炎性因子表达，进而起到神经免疫调控作用，最终缓解SDS引起的行为学改变。 4.PCMS通过抑制海马miR-210-3p表达，恢复自噬平衡，抑制炎症小体激活，最终增强对应激的抵抗性，缓解SDS引起行为学异常。 收起