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国家工程技术图书馆
2022年11月29日
摘要: 目的:探讨通过Cyp27b1敲除引起小鼠孕期活性维生素D缺乏对胎盘和胎鼠生长发育的影响。 方法:C57BL/6J小鼠通过Cyp27b1基因特异性sgRNA介导Cas9核酸切割小鼠DNA构建Cyp27b1杂合(Cyp27b1+/-)小鼠。Cyp27b1+/-雌鼠与Cyp27b1+/-雄鼠交配得到Cyp27b... 展开 目的:探讨通过Cyp27b1敲除引起小鼠孕期活性维生素D缺乏对胎盘和胎鼠生长发育的影响。 方法:C57BL/6J小鼠通过Cyp27b1基因特异性sgRNA介导Cas9核酸切割小鼠DNA构建Cyp27b1杂合(Cyp27b1+/-)小鼠。Cyp27b1+/-雌鼠与Cyp27b1+/-雄鼠交配得到Cyp27b1+/+雌鼠与Cyp27b1+/-雌鼠。小鼠饲养于清洁级鼠房,自由饮食饮水,保持12h昼夜节律,湿度、温度适宜。为研究胎鼠的发育,Cyp27b1+/+雌鼠与Cyp27b1+/-雌鼠分别与Cyp27b1+/+雄鼠于晚上9点合笼,次日早上8点检查雌鼠是否有阴栓,有阴栓即视为受孕成功,记为妊娠0天即GD0。将孕鼠分为Cyp27b1+/+组、Cyp27b1+/-组和1α,25(OH)2D3+Cyp27b1+/-组,每组10只孕鼠。在整个孕期,1α,25(OH)2D3+Cyp27b1+/-组每天经皮下注射1α,25(OH)2D3(500pg/kg),Cyp27b1+/+组和Cyp27b1+/-组每天经皮下给予等容量溶剂。观察记录整个孕期各组孕鼠的食物消耗和体重增长情况。GD18经苯巴比妥钠(50mg/kg)麻醉后处死孕鼠。留取孕鼠血清和胎盘,计数每窝活胎、死胎和吸收胎数,称量胎鼠重量、胎鼠顶臀长、胎盘重量和胎盘直径。比较各组胎鼠重、胎鼠顶臀长和胎鼠宫内生长受限率,探讨活性维生素D缺乏对胎鼠生长发育的影响。比较各组胎盘重、胎盘直径的差异,并用H&E染色观察胎盘结构变化、用TUNEL试剂盒检测胎盘细胞凋亡,用IHC检测各组胎盘Ki67和CD34的表达与分布情况、用实时RT-PCR法检测Glut-1和Fatp-4mRNAs的水平,研究孕期维生素D缺乏对胎盘细胞凋亡、增殖,血管发育和物质转运功能的影响。为研究孕期维生素D缺乏对胎盘炎症的影响,用实时RT-PCR检测胎盘促炎因子Tnf-αmRNA和炎性趋化因子Mcp-1和Kc mRNAs的表达情况、用免疫印迹法检测胎盘细胞核NF-κB p65的表达情况。此外,为研究孕妇孕期维生素D缺乏对胎儿和胎盘生长发育的影响,从安徽医科大学第一附属医院招募到59名孕妇志愿者。收集孕妇血清和胎盘,称量胎儿体重,测量胎盘直径和胎盘厚度。用酶联免疫吸附法检测孕妇血清TNF-α蛋白的水平,用实时RT-PCR法检测胎盘TNF-α、MCP-1和KC mRNAs的表达情况、用Western blotting和IHC检测胎盘NF-κB p65的表达和分布情况。 结果:三组孕鼠在孕期食物消耗和体重增长情况无明显统计学意义。Cyp27b1+/-能引起胎盘Cyp27b1和Cyp24a1mRNAs的降低,与Cyp27b1+/+组相比差异有统计学意义。通过分析各组胎鼠体重和顶臀长发现,Cyp27b1+/-组、Cyp27b1+/+组和1α,25(OH)2D3+Cyp27b1+/-组的胎鼠体重分别为(1.09±0.09)g、(0.98±0.09)g和(1.08±0.07)g,顶臀长分别为(21.91±0.83)mm、(20.24±0.98)mm和(21.62±0.84)mm。与Cyp27b1+/+组相比,Cyp27b1+/-组的胎鼠体重和顶臀长显著降低。而补充1α,25(OH)2D3后,胎鼠体重和顶臀长与Cyp27b1+/-组相比明显升高,差异有统计学意义。根据IUGR的定义引进IUGR率发现Cyp27b1+/-组、Cyp27b1+/+组和1α,25(OH)2D3+Cyp27b1+/-组的胎鼠IUGR率分别为(9.45±3.44)%、(42.55±3.44)%和(24.39±4.32)%。Cyp27b1+/-组与Cyp27b1+/+组相比IUGR率明显升高,而1α,25(OH)2D3+Cyp27b1+/-组与Cyp27b1+/-组相比IUGR率显著降低,差异均有统计学意义。对胎盘的分析发现,Cyp27b1+/-组胎盘重显著低于Cyp27b1+/+组(0.076±0.017vs0.086±0.029),Cyp27b1+/-组胎盘直径也显著低于Cyp27b1+/+组(7.46±0.52vs8.24±0.77),差异均有统计学意义。而1α,25(OH)2D3补充能提高Cyp27b1+/-小鼠的胎盘重(0.076±0.017vs0.083±0.004)和胎盘直径(7.46±0.52vs8.03±0.29)。胎盘组织学分析发现,各组之间TUNEL阳性细胞占比无明显统计学差异,而Cyp27b1+/-组胎盘Ki67的表达水平明显低于Cyp27b1+/+组,补充1α,25(OH)2D3能提高Cyp27b1+/-小鼠胎盘Ki67的表达水平。Cyp27b1+/-组胎盘血窦面积和CD34的表达水平明显低于Cyp27b1+/+组,1α,25(OH)2D3+Cyp27b1+/-组胎盘血窦面积和CD34的表达水平明显高于Cyp27b1+/-组,差异均有统计学意义。用实时RT-PCR分析发现,Cyp27b1+/-组胎盘Glut-1和Fatp-4mRNAs的表达显著低于Cyp27b1+/+组,而1α,25(OH)2D3的补充能提高Cyp27b1+/-小鼠胎盘Glut-1和Fatp-4mRNAs的表达。孕期维生素D缺乏对胎盘炎症影响的分析发现,孕期活性维生素D缺乏能引起胎盘Tnf-α,Mcp-1和Kc mRNAs表达的升高,并能引起胎盘细胞核内NF-κB p65水平的上升。而补充1α,25(OH)2D3能显著降低Cyp27b1+/-小鼠胎盘Tnf-α,Mcp-1和Kc mRNAs及细胞核NF-κB p65的水平。对人群样本的研究发现,VDD组胎儿的出生体重低于Ctrl组(3002±470vs3296±505),差异有统计学意义。虽然VDD组的胎盘厚度与Ctrl组相比无明显统计学差异,但VDD组的胎盘直径显著低于Ctrl组(19.00±1.44vs20.29±2.48)。进一步研究发现,VDD组胎盘TNF-α,MCP-1和KC mRNAs的水平和胎盘细胞核内NF-κB p65的表达显著高于Ctrl组。 结论:孕期维生素D缺乏通过引起胎盘炎症,抑制胎盘增殖,破坏胎盘的血管生成、葡萄糖和脂肪酸转运等物质交换功能,从而诱发胎儿宫内生长受限。 收起
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