摘要: 山茶属隶属于山茶科，包含了许多具有重要经济价值的物种，其中最引人注目的是茶组植物，茶花和油茶。但由于山茶属植物为异花授粉植物，具有遗传背景复杂和杂合度较高等特点，导致该属植物在系统分类和进化上存在着较大的差异。形态学观测和分析是研... 展开 山茶属隶属于山茶科，包含了许多具有重要经济价值的物种，其中最引人注目的是茶组植物，茶花和油茶。但由于山茶属植物为异花授粉植物，具有遗传背景复杂和杂合度较高等特点，导致该属植物在系统分类和进化上存在着较大的差异。形态学观测和分析是研究植物种质资源最基础的方法，也是物种鉴定，遗传多样性及进化分析的重要依据。因此，本研究对山茶属中的茶组植物，茶花和油茶的果实和花性状进行了观测和统计分析，丰富了其表型数据，并基于转录组数据对影响花发育相关的MADS-box，MYB以及抗性相关的WRKY基因家族进行了比较进化分析，找到了可能与花性状发育相关的候选基因。此外，基于转录组测序数据，构建了山茶属单拷贝直系同源基因系统进化树，为进一步研究该属植物的分类和系统进化提供了参考。最后，本研究建立并优化了山茶属植物的荧光原位杂交技术，为后续在染色体水平上研究该属植物的比较进化提供了基础。主要结果如下: (1)通过对茶组植物，茶花以及油茶的果实和花性状的统计和变异分析发现，这些性状具有组间差异显著，而组内差异较小的特点。具体而言，在果实方面，茶组植物的果实存在多种形态;凹脉金花茶的果实形状是多边形;怒江山茶和云南山茶的果实形状均为扁圆形;油茶的果实形状多为椭圆或者圆形。花性状方面，在柱头先端的分裂程度上，除凹脉金花茶的雌蕊柱头先端分裂较深外，其它种柱头分裂均较浅，一般分为3.4个柱头。在雄蕊形态及数目上，除油茶外，其它种都能观察到粗雄蕊(靠近雌蕊的那一轮雄蕊，基部膨大)的存在，且粗雄蕊的长度相差不大;凹脉金花茶的雄蕊总数最多，而怒江山茶和油茶的雄蕊总数较少。在此基础上，从果实和花等9个性状(种子纵横径，雄蕊总数，外围最长雄蕊长度，外围最短雄蕊长度，粗雄蕊总数和长度，花瓣长度和宽度)的相关性分析结果发现，部分性状间存在显著的相关关系。 (2)本研究通过RNA-seq测序，在油茶的花、叶和果实三个组织中获得了21.97Gb的高质量数据，经拼接组装后得到83，545条非冗余的Unigenes，其中有53,436条转录本在公共数据库中得到注释。通过代谢通路分析，从中鉴定到了12个参与α-亚麻酸代谢过程的关键酶基因，并对FAD3(Omega-3fatty acid desaturase)基因在油料作物中的进化进行了分析，发现油茶的FAD3基因跟大豆的FAD3基因关系较近。此外，这些测序组装结果还为本研究后续的比较进化分析提供了数据来源。 (3)基于RNA-seq和基因组数据对与花形态发育(MADS-box)，花色(MYB)以及与抗性相关的WRKY转录因子进行了比较分析。从ABCDE同源异型基因来看，除了B类基因外，其它类的基因数目基本都呈现一种趋势:云南山茶，怒江山茶和油茶＞凹脉金花茶，大理茶＞云抗10号。根据进化分析，ABCDE同源异型基因可以再划分为不同的亚类，而这些亚类基因在这6个山茶属植物中都或多或少地发生了缺失或者扩增。PI(PIS-TILLATA)基因在怒江山茶和油茶中发生了缺失，而相应的其雄蕊数目也较其它种少很多，因该基因在花瓣和雄蕊发育过程中所发挥的关键作用，推测PI基因对雄蕊数目的分化可能具有一定的调控作用;D类MADS-box基因广泛参与雌蕊、雄蕊和柱头的形态建成，但该类基因在凹脉金花茶中发生了缺失，同时结合性状数据，发现除了凹脉金花茶的柱头先端分裂较深外，其它5个种的都是浅裂，因此推测凹脉金花茶中该类基因的缺失可能对其具有一定的影响。在与花色相关的MYB类转录因子进化上，发现怒江山茶，云南山茶，凹脉金花茶和大理茶较为接近，而油茶和云抗10号较为接近。在WRKY基因的进化上，选取了猕猴桃，葡萄和胡萝卜作为外类群与6种山茶属植物进行比较，发现WRKY基因可以划分为9个亚类，其中胡萝卜的Ⅰa类基因最少，而Ⅱ-b，Ⅱ-d和Ⅱ-e类基因数目最多。同时发现WRKY基因数目与植物的基因组大小没有很好的正相关性。WRKY基因在胡萝卜染色体上不均衡分布，并且有一半以上的WRKY基因是由全基因组重复事件产生的。对胡萝卜进行激素和机械损伤处理发现，部分WRKY基因在激素和机械损伤应答过程中发挥作用。另外，在WRKY基因的进化上，发现凹脉金花茶，怒江山茶和云南山茶较为接近，而大理茶和云抗10较为接近。 (4)在转录组水平上对茶组植物、茶花和油茶进行了比较进化分析:构建了高支持率的山茶属植物直系同源基因系统进化树。其中凹脉金花茶跟茶组植物亲缘关系相对较近，聚在一个大的分支上，而厚轴茶聚在了茶组植物的基部位置。在密码子偏好性聚类和单拷贝直系同源基因系统发育树中，云抗10号和龙井43都被聚在不同的分支上，进一步表明它们的亲缘关系相对较远。此外，还鉴定了大量的EST-SSR位点。 (5)建立并优化了荧光原位杂交流程，特别是在野生种质资源根尖的获取上，筛选了一个获取根尖的最好方法，解决了根尖缺少的问题，为后续实验提供了先决条件。同时还对最佳取根时间，制片方法，共变性时间，探针浓度以及洗脱浓度进行了梯度筛选，制备出来的装片中染色体中期分裂相较多，染色体形态较好，杂交信号背景少，信号较清晰。最后，还完成了45S rDNA在云抗10号和龙井43上的初步定位，证明了体系的可靠性，为后续在染色体水平上研究山茶属植物的比较进化打下了基础。 收起