摘要: 在仿生矿化领域，如何通过人工合成的方法来模拟骨组织精妙的多分级矿化结构，进而形成具有与自然骨组织各项性能相媲美的硬组织缺损修复材料是当前的研究热点及难点问题。自然骨组织的矿化是无机矿物相在有机胶原基质内部有序沉积的过程，这一过程受... 展开 在仿生矿化领域，如何通过人工合成的方法来模拟骨组织精妙的多分级矿化结构，进而形成具有与自然骨组织各项性能相媲美的硬组织缺损修复材料是当前的研究热点及难点问题。自然骨组织的矿化是无机矿物相在有机胶原基质内部有序沉积的过程，这一过程受到酸性非胶原蛋白的精密调控。受到这一过程的启发，国际上多个课题组利用聚羧酸类电解质模拟酸性非胶原蛋白的功能性区域，在体外实现了I型胶原的纤维内仿生矿化，并试图利用此类仿生矿化模型来揭示生物矿化的本质。然而，当前的仿生矿化研究所使用的有机模板均为裸露的、未经修饰的胶原支架材料，与自然骨组织中胶原纤维/非胶原蛋白聚合体的形式相距甚远；非胶原蛋白类似物游离于矿化溶液中，造成矿化效率低、周期长及矿化深度受限；体内流动的体液环境造成局部非胶原蛋白类似物无法达到有效浓度而诱发矿化。这些问题不仅限制了仿生矿化技术的临床转化，同时也降低了仿生矿化模型在生物矿化机制研究中的应用价值。 为解决上述问题，本研究借鉴骨组织中胶原基质表面结合有大量非胶原蛋白的特点，将非胶原蛋白类似物——高分子量聚丙烯酸(high molecular weight polyacrylic acid, HPAA)通过共价结合的方式锚定在胶原纤维表面，构建出一种新型的胶原/聚电解质复合体。利用锚定在胶原分子表面的大量HPAA羧基官能团快速富集矿化液中的矿化前体，通过在胶原内外建立渗透压力差和电荷差，促使矿物质持续单向的进入胶原纤维内部，形成广泛的仿生纤维内矿化。从仿生矿化机制研究领域而言，胶原/聚电解质复合体高度模拟了骨组织中胶原有机质和非胶原蛋白的位置关系和相互作用关系，为体外探讨生物矿化的本质提供了一种更加仿生的模型；从组织工程支架材料领域而言，我们构建了一种具有自发诱导纤维内矿化作用的胶原支架材料，解决了非胶原蛋白类似物原位输送困难的问题，为临床骨缺损的修复奠定了理论基础并提供了新方向。 1.研究思路 在第一部分实验中，我们优选两种富含羧酸的聚阴离子电解质——高分子量聚丙烯酸(HPAA)和低分子量聚丙烯酸(LPAA)作为非胶原蛋白类似物。以二维单层重组鼠尾胶原和三维重组I型胶原海绵支架为模型，通过碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的交联作用实现胶原分子表面氨基与聚丙烯酸羧基的共价键和，在胶原表面引入大量羧基基团。并通过钌红/醋酸双氧铀双染色法在透射电镜(TEM)下观察确定胶原与聚电解质的结合位点。为从多个角度综合表征胶原/聚电解质复合体的各项理化性质，共价结合聚电解质前后，通过傅里叶变换衰减全反射红外光谱法(ATR-FTIR)检测胶原分子表面官能团的变化，Zeta电位检测胶原表面电势的变化，亚甲蓝吸附实验和TNBS实验定量分析胶原分子上胺基和羧基含量的变化，最后通过高效液相色谱法(HPLC)鉴定胶原与聚丙烯酸共价结合的化学键并检测稳定性。 在第二部分实验中，我们以传统的仿生矿化方式为对照，检测新型胶原/聚电解质复合体诱发纤维内矿化的能力，并分析了其可能的机制。我们首先构建了不含非胶原蛋白类似物的超饱和钙磷溶液，并利用动态光散射(DLS)、Zeta电位分析及冷冻电镜技术对其进行表征，以传统仿生矿化所使用的HPAA稳定的钙磷溶液为对照，来探索不同类型矿化溶液的特征。进而通过TEM筛选出能够在不添加非胶原蛋白及其类似物的环境中自发诱导纤维内矿化的胶原/聚电解质复合体模型。利用不同的胶原类型反复验证该模型诱导纤维内矿化的有效性，证实该模型的普适性。最后，利用冷冻电镜和分子动力学模拟还原胶原、聚电解质、矿物质离子之间的空间及动态关系，探索三者之间的相互作用机制以及蕴藏其中的仿生矿化原理。 在第三部分实验中，我们综合评价了胶原/聚电解质复合体纤维内矿化前后的理化性能、机械性能和生物相容性，为其在组织工程学中的应用奠定实验基础。我们利用X射线衍射(XRD)鉴定纤维内矿物质晶型，结合热重分析(TGA)检测材料的矿物质含量及热力学降解模式，采用动态傅里叶红外光谱法(Dynamic FTIR)追踪纤维内矿物质晶体形成过程，利用单轴压缩应力应变曲线测试及原子力显微镜检测材料的机械力学性能，通过MTT检测和流式细胞术初步评估材料的生物安全性。 2.实验结果 第一部分胶原/聚电解质复合体的构建及表征 (1)在交联剂EDC和NHS的作用下，聚丙烯酸分子链上的羧基被大量活化，并与胶原分子氨基酸侧链上携带的胺基发生共价结合，形成表面携带大量功能性官能团的胶原/聚电解质复合体。 (2)钌红/醋酸双氧铀双染色结果可见共价结合聚丙烯酸的二维重组胶原表面有明显的丝状或团状阴影，甚至掩盖了胶原纤维特征性的横纹结构，通过这种阳离子染色法特异性地识别出胶原纤维上聚电解质的结合位点；FTIR结果显示共价结合聚丙烯酸后胶原分子特征性的酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ键及酰胺B键红外吸收峰显著增强；zeta电位分析结果表明由于聚丙烯酸的阴离子特性，显著降低了胶原/聚电解质复合体的zeta电位(胶原：-3.04±0.37mV，胶原/高分子量聚丙烯酸复合体：-17.17±1.98mV，胶原/低分子量聚丙烯酸复合体：-15.19±1.22mV，p均＜0.05)；亚甲蓝吸附实验和TNBS实验显示共价结合聚丙烯酸后，胶原分子上胺基含量显著减少而羧基含量显著增加(胶原：羧基含量0.460±0.017mM/g，胺基含量0.132±0.007mM/g；胶原/高分子量聚丙烯酸复合体：羧基含量1.907±0.084mM/g，胺基含量0.033±0.004mM/g；胶原/低分子量聚丙烯酸复合体：羧基含量1.807±0.035mM/g，胺基含量0.023±0.002mM/g，p均＜0.05)。 (3)HPLC结果证实胶原分子与聚电解质之间是通过共价键的方式结合，并且结合稳定性良好，材料长时间储存后未见聚电解质解离。为后续材料仿生矿化的探索提供了实验基础。 第二部分胶原/聚电解质复合体诱导胶原纤维内矿化及其机制研究 (4)首先分别构建出两种仿生矿化液：超饱磷酸钙矿化液(CaP)和HPAA稳定的超饱磷酸钙矿化液(HPAA-CaP)。发现在缺乏非胶原蛋白类似物(HPAA)作为成核抑制剂的条件下，单纯的CaP极不稳定，钙离子、磷酸氢根离子迅速凝聚成粒径极大(955.4 nm)的晶体析出。相反，HPAA-CaP的粒径则稳定分布在小颗粒峰区(18.2nm和91.3nm)。而在胶原/聚电解质复合体存在的条件下，CaP溶液呈现三个离散的粒径峰区(15.7nm、78nm和1000nm)，说明胶原/聚电解质复合体有效稳定了周围的矿物离子不发生凝集，但在远离复合体的区域，溶液仍不稳定。 (5)通过TEM快速筛选出了能够在不额外添加聚电解质的环境中诱导自身纤维内矿化的胶原/聚电解质复合体模型——交联高分子量聚丙烯酸(HPAA)的胶原模型。并通过两种不同的胶原模型(三维重组胶原海绵和二维重组鼠尾胶原)反复验证了胶原/聚电解质复合体诱导纤维内矿化的有效性。 (6)利用冷冻电镜极速原位玻璃化技术还原了液相矿化前体的真实形貌，以及矿化前体与胶原纤维的动态关系。发现锚定在胶原表面的HPAA能够快速吸附周围的预成核簇(PNC)单体形成链状的PNC聚集体，同时在胶原周围还观察到离散的低电子致密度的无定形磷酸钙(Amorphous calcium phosphate,ACP)。根据其大小和高度含水特性，推测PNC单体、PNC聚集体以及ACP三种矿化前体均具有进入胶原纤维内的条件，而PNC聚集体不论是在数量上还是在与胶原的位置关系上均更占优势，因此进入胶原内部形成纤维内矿化的主要是大量的PNC聚集体。这一结果解决了当前国际上存在很大争议的矿化前体的形式及构成问题。 (7)通过分子动力学模拟搭建胶原/聚电解质复合体模型，从分子级别上探索胶原、聚电解质、矿物质三者间的相互作用。发现锚定在胶原表面的HPAA因分子量过大而无法进入胶原内部空间，同时因其自身具有显著阴离子特性而在纤维外环境中造成电荷和渗透压差异，胶原内部形成负压，构成了无定形矿化前体渗入纤维内的驱动力，也是纤维内矿化的关键环节。该结果为本课题组前期提出的仿生矿化Gibbs-Donnan平衡机制提供了有力佐证。 第三部分胶原/聚电解质复合体诱导纤维内矿化的效果评价 (8)XRD鉴定结果证实仿生矿化后的胶原/聚电解质复合体所含矿物为羟基磷灰石晶体，热重分析检测表明矿化后的支架材料矿物质含量为77.03%，显著高于对照组的66.07%(p＜0.05)，说明材料在成分组成及矿物质含量上均高度接近自然矿化的骨组织。 (9)动态FTIR追踪矿化过程显示，相比于传统的仿生矿化方法，胶原/聚电解质复合体在矿化速度和程度上均有显著提高。有助于解决当前仿生矿化方式矿化周期长、矿化深度受限的问题。 (10)应力应变曲线结果显示仿生矿化后的胶原/聚电解质复合体韧性模量(352.7±81.4KPa)显著高于对照组传统仿生矿化胶原(266.7±121.5Kpa,p＜0.05)。同时，AFM结果显示矿化前的胶原、纤维外矿化的胶原、传统仿生纤维内矿化胶原、仿生矿化后的胶原/聚电解质复合体的杨氏模量依次升高，各组间差异均有统计学意义(p均＜0.05)，说明仿生矿化后的胶原/聚电解质复合体具有最佳的机械力学性能，其刚度、韧性及均一性均得到显著提高。 (11)MTT检测和流式细胞术显示相比于裸露的胶原海绵，共价结合聚电解质的胶原海绵未对MSC的活性、增殖和凋亡造成不良影响(p均＞0.05)，说明材料具有良好的生物相容性，为后续体内应用的探索奠定了良好的实验基础。 3.结论 本研究通过模拟生物体内矿化胶原基质表面存在大量非胶原蛋白修饰的结构特征，利用聚电解质与胶原蛋白共价交联的方式，构建了一种新型胶原/聚电解质复合体材料；全面评价了其诱导纤维内矿化的效果，并深入探索其矿化机制。本研究一方面为仿生矿化理念解释生物矿化现象提供了良好的仿生模型，另一方面胶原/聚电解质复合体快速而均匀的矿化效果，有助于解决当前仿生矿化方式中矿化周期长、矿化深度受限的问题。更为重要的是，这种新的矿化方式解决了非胶原蛋白类似物原位输送困难的难题，为构建具有自发诱导纤维内矿化作用的骨缺损修复材料提供了全新思路。 收起