摘要: 本论文第一部分针对硒蛋白质组展开研究。硒蛋白是指含有硒代半胱氨酸(Sec，selenocysteine)的一类蛋白质，硒代半胱氨酸具有很高的生物活性，因此硒蛋白在维持体内的氧化还原平衡方面发挥着重要功能。硒蛋白是非常特殊的一类蛋白质，它性质活泼，体内... 展开 本论文第一部分针对硒蛋白质组展开研究。硒蛋白是指含有硒代半胱氨酸(Sec，selenocysteine)的一类蛋白质，硒代半胱氨酸具有很高的生物活性，因此硒蛋白在维持体内的氧化还原平衡方面发挥着重要功能。硒蛋白是非常特殊的一类蛋白质，它性质活泼，体内具有多种氧化还原形式，且它的生物合成途径非常特殊，它利用终止密码子UGA作为密码子，将Sec插入到蛋白中，其中，mRNA3'UTR区域的一段Sec插入序列(SECIS，selenocysteine insertion sequence)在其中发挥着重要作用。目前为止，人类中有25种硒蛋白，小鼠中有24种硒蛋白被报道。新的硒蛋白的发现多是利用生物信息学的方法，针对硒蛋白SECIS序列进行预测得到的。这些硒蛋白与许多疾病密切相关，例如糖尿病、癌症和神经退行性疾病等。硒蛋白具有如此重要的功能，但是其性质特殊，含量低，数量少，硒代半胱氨酸和半胱氨酸性质接近，目前尚缺乏有效的分析方法，尤其是没有高通量地对硒蛋白进行分析的方法，关于硒蛋白的功能研究以及新的硒蛋白的发现进展缓慢。因此，开发有效的高通量的硒蛋白质组研究方法迫在眉睫。 针对以上现状，开发了一种基于质谱的硒蛋白研究方法，称之为SecMS（Sec-specific mass spectrometry）。这种方法利用硒代半胱氨酸比半胱氨酸具有较低的pKa值这一特性，实现了在低pH条件下对硒代半胱氨酸进行特异性衍生化进而进行富集。此外，还构建了不依赖于SECIS序列的硒蛋白(SECIS-independent selenoprotein，SIS)数据库，该数据库含有最大规模的潜在硒蛋白。结合SecMS和SIS数据库，不仅可以大规模地对已知硒蛋白进行研究，还可以发现新的硒蛋白。 利用SecMS方法，发现在BV2细胞中补充Sec可以大大提高细胞中硒蛋白的含量，硒蛋白含量的升高有利于细胞抵抗活性氧含量的升高。此外，用SecMS的方法对小鼠中的硒蛋白进行研究，在小鼠的9个组织中鉴定到了小鼠24个已知硒蛋白中的22个，且每个硒蛋白均鉴定到了其Sec位点信息，具有高可信度。发现,小鼠中的硒蛋白分布具有明显的组织特异性。随着年龄的增大，小鼠的硒蛋白整体呈现下降趋势，且在各组织中变化有所不同。尤为重要的是，结合SIS数据库，在小鼠的组织中发现了至少5个新的硒蛋白，它们均具有高度可信的谱图。这是十五年来首次报道发现新的硒蛋白，也是对硒蛋白质组的最大规模扩充，SecMS结合SIS数据库的方法将对硒蛋白的研究和新的硒蛋白发现产生深远的意义。 言而总之，开发了新的硒蛋白研究方法SecMS，不仅可以对已知硒蛋白进行研究，还可以发现新的硒蛋白。硒蛋白可以抵抗细胞中活性氧含量的升高，维持细胞内的氧化还原平衡。硒蛋白随着年龄增大呈现下降趋势，因此可能在衰老及相关疾病中发挥重要的作用。最为关键的是，本研究报道发现了5个新的硒蛋白。 本论文第二部分是针对阿司匹林的乙酰化蛋白质靶点及其作用机制展开。阿司匹林也叫乙酰化水杨酸，是广泛应用的解热镇痛抗炎药。最病风险、抗癌、延长寿命等。阿司近的研究报道了一些阿司匹林作用的新功能，例如降低心脏病患匹林功能如此重要，但是关于阿司匹林的作用机制研究却相对匮乏。比较明确的机制是通过将环氧化酶COX-2的S516位点乙酰化，进而抑制前列腺素的生成来发挥解热镇痛抗炎的功效。 为了在系统层面研究阿司匹林引起的蛋白质乙酰化靶标，合成了氘同位素标记的阿司匹林，开发了一种基于质谱的方法来研究在体内阿司匹林引起的乙酰化蛋白质组学的变化，称之为“DAcMS”(Deuterium-labeled aspirin induced Acetylome by Mass Spectrometry)。通过深度研究阿司匹林引起的乙酰化蛋白质组学变化，研究阿司匹林的乙酰化作用靶点和机制。 利用合成的氘同位素标记的阿司匹林(D-ASA)可以使与阿司匹林作用的底物蛋白带上同位素标记的乙酰基修饰，这种重标乙酰化修饰可以特异性地被高分辨质谱检测。首先，用DAcMS的方法研究了两个细胞系中乙酰化蛋白质组学的变化，分别为LPS刺激产生炎症的BV2细胞系和结肠癌细胞系HCT116。在这两个细胞系中，鉴定了由D-ASA引起的乙酰化蛋白质组学变化。利用DAcMS的方法，在BV2细胞中鉴定到了14429个乙酰化位点，4159个乙酰化蛋白。在HCT116细胞中，鉴定到了18107个乙酰化位点，4796个乙酰化蛋白。这些乙酰化蛋白的功能在两个细胞模型中分别与炎症和癌症密切相关。 接下来用不同剂量的D-ASA喂养Balb/c小鼠，研究小鼠不同组织中由阿司匹林引起的乙酰化蛋白。发现，在小鼠的脑、肝脏、肺和血浆中鉴定到的阿司匹林引起的乙酰化位点与细胞水平大不相同，仅有少数位点可以被阿司匹林乙酰化。在高、低剂量组中，分别鉴定到了101个与76个阿司匹林引起的乙酰化蛋白。阿司匹林引起的乙酰化蛋白具有明显的组织特异性。在新发现的阿司匹林的乙酰化靶点中，DAc19蛋白上的乙酰化位点可能可以抑制Aβ42纤维形式从胞外转运到细胞中。 在本论文的第二部分研究了阿司匹林引起的乙酰化蛋白质组学的变化，揭示了阿司匹林在不同生物学过程中的作用。DAc19作为一个全新的阿司匹林引起的乙酰化靶点在炎症和神经退行性疾病中都发挥着重要作用。DAcMS的方法可以精确地研究由阿司匹林引起的乙酰化蛋白靶点，从而发现阿司匹林新的作用机制。 收起