摘要: 核酸荧光探针由于具有水溶性好、热稳定性好、易于合成和修饰等优点，在生物传感中发挥着越来越重要的作用。核酸荧光探针除了具有与DNA或RNA杂交的常规功能外，核酸可以识别离子、小分子、蛋白以及细胞。核酸也可以作为各种核酸酶的底物，广泛用于酶... 展开 核酸荧光探针由于具有水溶性好、热稳定性好、易于合成和修饰等优点，在生物传感中发挥着越来越重要的作用。核酸荧光探针除了具有与DNA或RNA杂交的常规功能外，核酸可以识别离子、小分子、蛋白以及细胞。核酸也可以作为各种核酸酶的底物，广泛用于酶的识别、活性检测、机理研究及抑制剂筛选和药物发现。核酸荧光探针可用于信号放大，将生物识别信号通过杂交、靶标结合或酶消化转化成荧光信号。本论文设计了一系列新型核酸荧光分子探针，研究了如何有效降低背景噪音、减少复杂体系的信号干扰、提高检测特异性和灵敏度，实现了对疾病相关生物标志物的超灵敏检测。本论文主要开展了以下几方面的工作： （1）建立了一种基于两种碱基类似物标记的核酸荧光探针循环切割信号放大同时检测多种DNA糖基化酶的方法。我们设计含有一个8-氧代鸟嘌呤（8-oxoG）和五个尿嘧啶碱基（U）修饰的双功能DNA探针，它与触发探针杂交形成三明治结构的DNA，作为人8-氧代鸟嘌呤（8-oxoG）DNA糖基化酶1（hOGG1）和尿嘧啶-DNA糖基化酶（UDG）的底物。另外，我们设计了分别含有2-氨基嘌呤(2-AP)和吡咯-dC(P-dC)的两种信号探针分别作为hOGG1和UDG的信号指示。当hOGG1和UDG存在时，通过Lambda外切核酸酶的循环切割来启动信号扩增过程，产生不同的荧光信号，实现两种糖基化酶的同时检测。该方法可以同时检测两种DNA糖基化酶，检测限为分别为0.0035U/mL（hOGG1）和0.0025U/mL（UDG），甚至可以在单个细胞水平上检测DNA糖基化酶。而且该方法可用于酶动力学参数的测定和DNA糖基化酶抑制剂的筛选，在生物医学研究和临床诊断中具有潜在的应用价值。 （2）发展了一种基于酶标记结合单分子荧光计数检测多种DNA损伤类型的方法。首先利用DNA碱基切除修复（BER）途径中的酶去除DNA中的损伤碱基，随后通过末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）以不依赖模板的方式在切除损伤碱基的位点精确地添加生物素标记的核苷酸（biotin-dNTP）和荧光标记的核苷酸（AF488-dUTP），最后通过单分子计数实现DNA损伤水平的定量。我们的方法克服了以往方法不能检测成群聚集的损伤的缺陷，两个损伤碱基的距离无论是在一个超螺旋内还是大于一个超螺旋的距离都可以被检测的到。通过改变识别特定损伤碱基的DNA糖基化酶，可以用同一种biotin-dNTP检测各种DNA损伤类型（例如，8-氧代-7,8-二氢鸟嘌呤（8-oxoG）、尿嘧啶和脱氧肌苷）而无需考虑与损伤碱基配对的碱基类型。该方法具有高特异性和高灵敏度，对于8-氧代鸟嘌呤（8-oxoG）损伤碱基的检测限为3.43×10-16M，并且能够在复杂的DNA混合物中区分0.001％的8-oxoG水平。更重要的是我们的方法可以检测不同细胞中的损伤水平，可以区分癌细胞与正常细胞中DNA损伤水平，对损伤的研究及损伤相关疾病的检测具有潜在的应用价值。 （3）发展了一种基于8-氧代鸟嘌呤（8-oxoG）损伤碱基修饰的核酸荧光探针循环切割信号放大检测DNA甲基化的方法。我们设计一种8-氧代鸟嘌呤（8-oxoG）损伤碱基修饰的荧光探针，其5′端修饰ROX荧光基团，3′端修饰BHQ2猝灭基团。经亚硫酸盐处理后，非甲基化序列中的胞嘧啶C碱基变成脱氧核糖尿嘧啶U碱基，而甲基化的胞嘧啶C碱基保持不变。亚硫酸盐处理后的甲基化序列与荧光探针杂交形成mC/8-oxoG碱基对，hOGG1糖基化酶可以识别并切割mC/8-oxoG碱基对中的8-oxoG碱基，信号探针断裂，荧光基团和猝灭基团分离，从而释放出使荧光信号循环放大。而亚硫酸盐处理后的非甲基化序列中的U碱基与荧光探针配对形成U/8-oxoG碱基对，hOGG1糖基化酶几乎不能切割U/8-oxoG碱基对中的8-oxoG碱基，因此信号探针不能被切割，从而不能释放出荧光。该方法灵敏度好、特异性高、可以检测单个甲基化位点，极限达到3.458×10-15M。而且该方法能在复杂的DNA混合体系中区分出0.01%的甲基化水平，也可以检测基因组中的DNA甲基化水平，在表观遗传学评估和癌症的早期诊断中具有潜在应用价值。 （4）利用一种基于无碱基位点修饰的核酸荧光探针级联信号放大检测非编码lncRNA和miRNA的方法。为了去除基因组DNA污染带来的假阳性信号，我们利用特异性的捕获探针直接捕获靶标非编码RNA，并利用磁珠（MB）实现分离和浓缩。然后引入双链特异性核酸酶（DSN）循环切割与非编码RNA配对的捕获探针，产生大量具有3′-OH末端的ssDNA片段。由此引发末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）可以在具有3′-OH末端的ssDNA片段末端进行聚合反应生成polyA序列。我们设计一个富含T碱基的信号探针，3′和5′端分别标记BHQ1和FAM，中间带有一个无碱基损伤位点（AP位点）修饰。信号探针与polyA杂交，可以被脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶（APE1）切割释放出荧光信号。而切割后的信号探针在AP位点处形成3′-OH末端，进而再次引发TdT介导聚合反应和APE1辅助的信号探针的循环切割，释放出大量的荧光信号。该方法对lncRNA的检测限为0.0716fM，miRNA的检测限为0.06fM，而且可以用于检测细胞中的内源性miR-486-5p和lncRNA HOTAIR，甚至可以检测到2个细胞中的lncRNA HOTAIR。 收起