摘要: 固有免疫系统通过模式识别受体监视胞内外危险信号，并针对病原体或自身的组织损伤产生免疫应答。环腺苷-鸟苷合成酶（cGAS）是胞内最主要的DNA识别受体，识别和结合病原体DNA后可催化ATP和GTP产生cGAMP，后者将活化信号传递给干扰素基因刺激蛋白（ST... 展开 固有免疫系统通过模式识别受体监视胞内外危险信号，并针对病原体或自身的组织损伤产生免疫应答。环腺苷-鸟苷合成酶（cGAS）是胞内最主要的DNA识别受体，识别和结合病原体DNA后可催化ATP和GTP产生cGAMP，后者将活化信号传递给干扰素基因刺激蛋白（STING），并进一步活化下游TBK1-IRF3通路，诱导机体产生干扰素以对抗病原体入侵。Ⅰ型单纯疱疹病毒（HSV-1）是一种典型的双链DNA病毒，感染后可在生物体内长期潜伏。近年的研究发现，cGAS/STING介导的DNA识别信号通路在宿主对抗多种DNA病毒的过程中发挥着至关重要的作用，其中包括HSV-1。因此，DNA病毒如何逃逸cGAS/STING介导的DNA识别通路是其能否成功感染宿主细胞的关键，系统地筛选抑制该信号通路的病毒蛋白，揭示其逃逸宿主抗病毒天然免疫及致病的分子机制，为鉴定新型药物作用靶点以及为构建新型疫苗提供科学理论依据。但是，目前国际上针对病毒如何靶向调控胞内DNA识别通路的研究才刚刚起步。 本课题通过双荧光素酶报告基因（DLR）检测方法在HEK293T细胞中系统地筛选了抑制cGAS/STING介导的DNA识别信号通路的HSV-1蛋白，并运用实时荧光定量PCR等方法对筛选结果进行了验证，发现皮层蛋白UL41可以显著抑制DNA识别信号诱导的IFN-β，UL41是一种具有核酸内切酶活性的晚期蛋白。接下来通过 DLR检测系统结合定量PCR、ELISA、Native Page、Western blotting等实验技术以及利用野生型（WT）HSV-1和细菌人工染色体技术构建的UL41缺失突变病毒（R2621），研究UL41抑制宿主DNA识别信号通路的分子机制。最后，用RNAi技术和嘌呤霉素筛选得到稳定干扰cGAS的HFF细胞系，通过Western blotting和病毒滴度检测确定干扰cGAS是否影响WT HSV-1和R2621复制，以阐明UL41在HSV-1致病机制中的作用。研究发现，WTHSV-1感染可以显著抑制干扰素刺激DNA（IFN stimulatory DNA，ISD）诱导产生的IFN-β以及IRF3的磷酸化和二聚化，而R2621的抑制作用明显弱于WT HSV-1。此外，定量PCR和ELISA实验结果显示，过表达UL41能在mRNA水平和蛋白水平显著抑制cGAS/STING诱导的IFN-β的表达。DLR检测结果表明，过表达UL41可以抑制IFN-β的启动子活性，但是对信号通路上其它蛋白STING、TBK1以及激活突变体IRF3/5D激活的IFN-β启动子活性基本没有影响，这说明UL41抑制cGAS/STING介导的DNA识别信号可能是通过直接作用于cGAS。进一步研究发现，不同于R2621，WT HSV-1感染显著下调细胞内cGAS的mRNA和蛋白，而对STING、TBK1、IRF3表达基本无影响。Western blotting和病毒滴度实验发现，干扰细胞内cGAS蛋白表达不能显著影响高MOI的WT HSV-1复制，而有利于R2621的复制，这些结果说明cGAS在抗R2621复制过程中发挥极为重要的作用。综上所述，在cGAS/STING介导的DNA识别信号通路中，UL41利用其核酸内切酶活性，选择性降解cGAS mRNA并抑制其蛋白表达，以阻断宿主对HSV-1病毒DNA的识别，从而逃逸宿主的抗病毒天然免疫反应。 收起