摘要: 双光子显微镜能够在亚微米量级分辨率上获得生物体的三维图像，但是随着成像深度的增加，折射率不匹配会引入球差使得深层组织成像的荧光强度和分辨率严重下降，大大限制了双光子显微镜在光透明样品或厚组织样品中的应用。本文针对该像差的特点，采用... 展开 双光子显微镜能够在亚微米量级分辨率上获得生物体的三维图像，但是随着成像深度的增加，折射率不匹配会引入球差使得深层组织成像的荧光强度和分辨率严重下降，大大限制了双光子显微镜在光透明样品或厚组织样品中的应用。本文针对该像差的特点，采用了无波前探测的自适应光学技术对像差进行矫正，根据实际情况的复杂性，提出基于公式矫正和基于分环矫正的两种不同方案，并最终通过实验验证了这两种方法的有效性。 本文首先分析了在双光子显微成像中，波前像差的存在导致荧光信号强度和空间分辨率下降，由此提出利用自适应光学手段对其进行矫正的思路。首先从基本原理出发，从理论上推导了双光子荧光信号的探测公式和wolf矢量衍射公式，给出了球差存在时双光子显微系统的点扩散函数。以此为指导，设计了针对球差矫正的自适应双光子显微成像系统，并完成硬件和软件系统的搭建。 利用该系统，首先开展了单层折射率不匹配球差矫正的研究。针对光透明样品在双光子成像时会受到折射率不匹配影响的问题，本文先分析了折射率不匹配对双光子显微成像荧光强度和分辨率的影响，然后建立了由物镜特性数值孔径、浸润介质等、聚焦深度和物体折射率等参数构成的球差补偿模型，提出了基于该模型的矫正方案一。在对荧光小球仿体样品和光透明脑组织样品的双光子成像结果显示，该球差补偿方法能显著提升样品信号量和系统纵向分辨率。另外，该方法在矫正过程中无需多次成像，操作简单且时间短，对光透明剂和显微物镜无特殊要求，具有较强的通用性。 在方案一的基础上，本文进一步研究了多层折射率不匹配的问题。针对该问题本文首先分析了该类问题下像差的特点，然后结合模式法与分区域法的特点提出了方案二——环形矫正法。比较现有四种方法，数值仿真结果表明，环形矫正法能够精确的矫正圆对称像差而不会受到其他像差的影响，其矫正效率是其他方法的~8倍。进一步实验结果显示，环形矫正法可以使水镜下250?m处的荧光小球的荧光强度提升两倍，对经组织光透明剂处理的的Thy1-GFP转基因小鼠脑切片成像表明，该方法能够有效的矫正球差提高荧光信号量，降低双光子成像造成的光损伤和光漂白。 收起