摘要: γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，简称GABA）是一种天然存在的非蛋白质氨基酸，具有降低血压、镇定安神、预防癫痫、调节激素分泌、改善睡眠、抗抑郁和保肝利肾等多种生理功能，因此受到广泛关注。在制备GABA的多种方法中，生物催化合成法因反应周期... 展开 γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，简称GABA）是一种天然存在的非蛋白质氨基酸，具有降低血压、镇定安神、预防癫痫、调节激素分泌、改善睡眠、抗抑郁和保肝利肾等多种生理功能，因此受到广泛关注。在制备GABA的多种方法中，生物催化合成法因反应周期短、环境友好而备受瞩目。大肠杆菌Escherchiacoli以其生长迅速、产量高等优点一度成为制备GABA的热门菌种，然而E.coli因存在安全隐患而无法应用于食品工业。因此，寻求更加安全、高效的GABA生产菌株显得尤为重要。 本文以工业化细胞工厂中的模式菌株Lactococcus lactis NZ9000为宿主细胞，通过代谢工程和微生物生理生化分析等技术手段考察了过表达Lc.lactis subsp.lactis CV56谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase，GAD)抗酸系统中的关键基因对其GABA合成性能的影响，同时探究了影响重组工程菌株催化活性的主要因素，并于最优反应条件下考察游离乳酸菌细胞催化性能。 首先，Lc.lactis subsp.lactis CV56基因序列分析显示gadB基因全长1401bp，编码466个氨基酸，理论推算的分子量约为53.8 kDa。与其它功能已知的GAD相类似，GADCV56含有高度保守的赖氨酸残基(K277)、苏氨酸残基(T213)和天冬氨酸残基(D245)，以及一段高度保守的{H(I/V)DAASGG}基序。通过构建重组载体pET28a-gadB及重组菌株E.coli BL21(DE3):pET28a-gadB，实现了GAD CV56在大肠杆菌中过量表达。所获取的重组GADCV56具有催化L-谷氨酸(L-Glu)生成GABA的能力，其最适pH为4.7，最适反应温度为50℃;且重组GAD热稳定性较高，在60℃条下保温2h后仍能保持40％以上的酶活。动力学常数测定显示其Km值为3.88 mM，Vmax为58.66U/mg。 采用PCR扩增技术获取编码GAD和Glu-GABA反转运蛋白的基因片段，分别构建至Lc.lactis NZ9000中，获取重组工程菌株Lc.lactis NZ9000:pNZ8148-gadB和Lc.lactis NZ9000:pNZ8148-gadCB。在摇瓶发酵条件下，两菌株与对照菌株Lc.lactis NZ9000的生长相似，外源基因的导入没有导致重组工程菌株生物量的明显下降。GAD在Lc.lactis NZ900中过量表达时，经诱导45h后，发酵液中GABA的含量是对照组的7.02倍;而在此基础上进一步过量表达Glu-GABA反转运蛋白时，菌体细胞中反应底物和产物的跨膜输送过程得到强化，从而表现出更高的催化活性，GABA产量是对照组的16.63倍。同时，将gadB-CV56基因片段克隆入pNZ8149中，并构建相应的表达系统，获得可直接应用于食品行业的食品级重组工程菌株Lc.lactis NZ3900:pNZ8149-gadB。 以Lc.lactis NZ9000:pNZ8148-gadCB为对象，考察静息态细胞催化时菌龄、缓冲体系、反应液pH值、温度、5'-磷酸吡哆醛(PLP)对其合成GABA能力的影响。研究结果显示其最适反应条件为:菌体诱导时间4h，以pH4.2的醋酸-醋酸钠缓冲液为反应体系，反应温度45℃。在最适反应条件下进行游离细胞转化实验，细胞体外催化60h后，Lc.lactis NZ9000:pNZ8148-gadB和Lc.lactisNZ9000:pNZ8148-gadCB催化合成GABA产量分别为37.71g/L和43.32g/L，是对照组的3.97和4.56倍。 收起