摘要: 缢蛏是我国四大海水养殖贝类之一,在浙江和福建已有数百年的养殖历史。随着沿海城市经济的发展,海洋污染日益加剧,已经严重威胁到了缢蛏的生存和生长,因此必须对目前的缢蛏种质资源进行合理的开发和利用。本研究克隆了缢蛏碱性磷酸酶基因,并研究了其在... 展开 缢蛏是我国四大海水养殖贝类之一,在浙江和福建已有数百年的养殖历史。随着沿海城市经济的发展,海洋污染日益加剧,已经严重威胁到了缢蛏的生存和生长,因此必须对目前的缢蛏种质资源进行合理的开发和利用。本研究克隆了缢蛏碱性磷酸酶基因,并研究了其在重金属铜、锌胁迫作用下的表达情况。具体研究内容如下: 1.缢蛏碱性磷酸酶基因的分子特性及其组织表达分析 以缢蛏为材料,根据实验室构建的缢蛏肝脏cDNA文库中已标注的EST序列,利用RACE技术克隆得到了缢蛏ALP基因的cDNA全序列。该序列全长1837 bp,5′端非翻译区为130 bp,3′端非翻译区为117 bp。开放阅读框(ORF)长度为1590 bp,可编码529个氨基酸,含有1个由5个氨基酸组成的信号肽。推测得到的缢蛏缢蛏碱性磷酸酶前体肽具有29个磷酸化位点,与人(Homo sapiens)的碱性磷酸酶3D结构有高度的相似性。同源分析表明,该基因编码的蛋白与合浦珠母贝(Pinctada fucat)ALP氨基酸序列的相似性最高为48%。系统进化分析表明,缢蛏与合浦珠母贝聚集在一起,但与脊椎动物中的鱼类、两栖类、哺乳动物距离较远。利用实时荧光定量PCR检测成体缢蛏的水管、斧足、腮、外套膜、肝脏及性腺6个不同组织中ALP基因的表达情况,结果显示缢蛏ALP基因在肝脏的表达量最高,其次为外套膜,在水管中的表达量最低。说明,成体缢蛏的碱性磷酸酶具有组织特异性。 2. Cu2+、Zn2+胁迫对缢蛏碱性磷酸酶基因表达的影响 运用荧光定量PCR技术分析Cu2+、Zn2+在不同剂量以及不同处理时间下对缢蛏不同组织ALP基因表达的影响。实验结果显示,Cu2+和Zn2+对缢蛏不同组织ALP基因的表达影响不尽相同:在Cu2+的胁迫下,缢蛏水管、腮、斧足、外套膜ALP基因表达呈现整体下降的趋势,肝脏中ALP基因的表达呈现先升高、后降低的趋势,性腺中ALP基因的表达量无明显变化;在Zn2+的胁迫下,水管、腮、外套膜ALP基因表达呈现先升高、后降低的趋势,斧足和肝脏中ALP基因的表达呈现整体持续升高的趋势,性腺中ALP基因的表达量无明显变化。实验结果还显示,不同浓度Cu2+、Zn2+以及不同处理时间与缢蛏ALP基因表达的存在一定的相关性。 3. Cu2+和Zn2+对缢蛏的急性毒性研究 用静态急性毒性试验方法,研究了12h、24h、36h、48h、72h和96h内重金属Cu2+、Zn2+对缢蛏的毒性影响。结果表明:Cu2+对缢蛏的2h、12h、24h、36h、48h、72h和96h的LC50为1.022 mg·L-1、0.623 mg·L-1、0.277 mg·L-1、0.194 mg·L-1、0.073 mg·L-1、0.064 mg·L-1和0.044 mg·L-1;Zn2+对缢蛏的2h、12h、24h、36h、48h、72h和96h的LC50为34.601mg·L-1、26.145mg·L-1、23.563mg·L-1、9,908mg·L-1、6.531mg·L-1、4.127mg·L-1和2.664mg·L-1。经过计算的到Cu2+和Zn2+对缢蛏的安全浓度分别为:0.004 mg·L-1、0.226 mg·L-1,说明Cu2+对缢蛏的毒性远大于Zn2+。此外,还初步探讨了Cu2+和Zn2+对缢蛏的急性毒性效应和致毒机理,且差异显著。 4.缢蛏SRAP-PCR体系的正交优化 运用L16(45)正交设计对影响缢蛏SRAP-PCR反应的5个因素:Taq酶浓度、Mg2+浓度、模板DNA浓度、dNTPs浓度、引物浓度在4个水平上进行了优化试验，PCR结果采用SPSS v16.0软件分析。结果表明,各因素对SRAP-PCR反应的影响依次为:引物>Taq酶>DNA模板DNA>Mg2+;缢蛏SRAP反应最佳体系为:在20μL PCR反应体系中,引物0.3μmolL-1、Taq酶0.5 U、模板DNA50 ng、dNTPs0.2 mmolL-1、Mg2+2 mmolL-1。用不同缢蛏的基因组DNA两次SRAP-PCR扩增,8对引物均能扩增出清晰且重复性好的普带。因而建立的缢蛏反应体系稳定可靠。 收起