摘要: 蚯蚓，又名地龙，是我国传统中药材之一，具有活血化瘀、痛经活络之功效。1983年日本学者从蚯蚓体内分离得到了一组具有纤维蛋白溶解能力的酶类物质，并将之命名为蚓激酶，视之为一种新型溶栓药物。自此，关于蚯蚓药理活性组分的研究越来越受到科研工... 展开 蚯蚓，又名地龙，是我国传统中药材之一，具有活血化瘀、痛经活络之功效。1983年日本学者从蚯蚓体内分离得到了一组具有纤维蛋白溶解能力的酶类物质，并将之命名为蚓激酶，视之为一种新型溶栓药物。自此，关于蚯蚓药理活性组分的研究越来越受到科研工作者的关注。随着对其药理作用研究的深入，蚯蚓抗肿瘤作用逐渐被人们发现，但以往关于蚯蚓抗肿瘤活性的研究多集中于其粗提取物的抑制肿瘤生长的作用，我们的前期预实验也表明其提取物确实可以抑制肿瘤细胞生长，而且其盐析产物除抑制肿瘤细胞生长外还可以降低细胞粘附性。因此，本文以赤子爱胜蚓为原料，以人乳腺癌MCF-7细胞株为研究对象，对新鲜赤子爱胜蚓体内的抗肿瘤活性蛋白成分进行了分离纯化以及鉴定，以筛选活性最强的蛋白组分，并探索其抗肿瘤细胞粘附的作用机制以及与紫杉醇联合使用后的抗肿瘤作用的变化，具体实验过程及结果见下文: 1、蚯蚓抗肿瘤蛋白(EFP)的分离纯化及鉴定。 实验以CCK-8法来检测蚯蚓提取物作用于MCF-7细胞后的细胞存活率，并结合得率来筛选抗肿瘤活性较高的蛋白成分。分离纯化过程为:制备匀浆，取上清液进行饱和硫酸铵分级盐析，细胞实验筛选各级蛋白沉淀抗肿瘤活性，然后经DEAE阴离子交换层析，S200凝胶层析，G10脱盐等过程得到一个具有较强抗肿瘤活性的单一蛋白，即EFP。 对该蛋白进行性质检测，电泳分析得到其分子量在25kDa左右，纤维蛋白平板实验显示EFP具有非常强的纤维蛋白溶解作用，经北京华大蛋白质研究中心检测，LC-MS等结果显示，EFP与赤子爱胜蚓纤溶酶A(Q8MX72)具有高度相似性。 2、EFP的抗肿瘤活性以及抗粘附机制研究 采用CCK-8法检测EFP的抑制MCF-7细胞生长的能力，结果表明EFP可以显著抑制MCF-7细胞的生长存活，作用弱于紫杉醇。划痕实验结果表明，EFP可以显著抑制MCF-7细胞的生长迁移。此外，实验过程中还发现，EFP具有较强的抗细胞粘附作用，经RT-PCR以及WesternBlot检测粘附因子FAK、CD44v6的表达，结果发现，EFP可以显著下调FAK、CD44v6在mRNA以及蛋白质水平的表达，这表明EFP的抗细胞粘附作用可能与下调FAK、CD44v6的表达有关。 3、EFP与紫杉醇联合使用后抗肿瘤细胞活性的检测 使用CCK-8法检测EFP与紫杉醇联合应用之后抗肿瘤活性的变化，结果表明，二者联合使用具有协同效果，紫杉醇的活性显著增强。采用免疫荧光法检测EFP与紫杉醇单独使用以及联合使用时MCF-7细胞内β-tublin的变化，结果表明，单独使用EFP对β-tublin并无明显作用，而联合使用组与单用紫杉醇组β-tublin的变化也无显著差异，这表明EFP不能增强紫杉醇抑制微管蛋白解聚的能力。 综上所述，EFP，即蚯蚓纤溶酶A，具有抑制MCF-7细胞生迁移、抗细胞粘附的作用，而且EFP还可以下调FAK、CD44v6的表达。与紫杉醇联合使用后，作用强度增加，而且该增强作用与EFP增加紫杉醇抑制微管蛋白解聚的能力无关。 本文对蚯蚓抗肿瘤活性蛋白EFP进行了分离纯化和活性研究，为蚯蚓在临床上的新应用提供了实验依据。 收起