摘要: 金刚烷胺对于流感病毒引起的流感疾病具有较好的疗效，畜牧养殖业中普遍应用，其主要作用机理是通过吸附作用结合于流感病毒上的M2受体蛋白，抑制病毒的复制、脱壳、感染等过程。M2受体蛋白作为金刚烷胺的作用受体，能与金刚烷胺特异性结合，具有开发... 展开 金刚烷胺对于流感病毒引起的流感疾病具有较好的疗效，畜牧养殖业中普遍应用，其主要作用机理是通过吸附作用结合于流感病毒上的M2受体蛋白，抑制病毒的复制、脱壳、感染等过程。M2受体蛋白作为金刚烷胺的作用受体，能与金刚烷胺特异性结合，具有开发成为金刚烷胺的特异性生物识别材料的潜力，本论文主要研究了将该蛋白作为金刚烷胺的生物识别材料的可行性。 本论文首先通过仪器检测法对金刚烷胺在鸡肉产品中的残留程度做了检测分析，对金刚烷胺在肉鸡养殖领域的使用情况做了调查；通过分子生物学方法建立了金刚烷胺受体蛋白的表达系统，研究了表达工艺、纯化工艺及复性工艺，评价了重组受体蛋白的亲和活性及其作为生物识别材料用于金刚烷胺残留检测的可行性，为违禁兽药的生物学检测分析提供技术参考，论文的主要成果如下： 1、采用仪器法对肉鸡养殖领域的金刚烷胺使用情况做了调查，结果表明，在肉鸡养殖中对于金刚烷胺等药物的依赖性依然较大，规模化养殖场和小型养殖户中都存在金刚烷胺的滥用问题，而且养殖规模越小，对于禁用兽药的使用越无序。药残检测结果显示，市售鸡肉产品中存在金刚烷胺残留，残留检出率分别为18.4%（19/103）、5.9%（4/68）和11.1%（8/72）不等，金刚烷胺在不同部位的药残含量有所差异，在鸡翅部位最高、鸡腿及肝脏次之，鸡脯肉中未检测到残留。 2、采用分子生物学技术建立了金刚烷胺受体蛋白的表达系统，研究了表达工艺、纯化工艺、复性工艺，评价了受体蛋白的亲和活性。研究结果表明，重组表达系统在37℃、200r/min条件下经3.5h后达到添加IPTG的最佳时间，IPTG诱导浓度为0.1mM，添加IPTG以后在20℃、100r/min条件下继续诱导表达16h，重组蛋白的表达量得到大幅提高，收获率为29.04mg/L。对重组蛋白的亲和活性评价结果表明重组蛋白对金刚烷胺的亲和常数为1.1×105，偶联比为4.2，显示出作为金刚烷胺生物识别材料的潜力。 3、建立了基于生物识别材料的亲和吸附和酶催化信号放大为特点的亲和检测体系，通过方阵法优化了亲和检测体系的反应参数：包被浓度为20μg/mL、金刚烷胺生物识别蛋白的浓度为0.25mg/mL、酶标抗体的稀释浓度为1：1000；评价了该亲和检测体系的特异性，其IC50值为459ng/mL，与同类药物金刚乙胺的交叉反应率为72%，对于其他养殖业常见违禁药物的交叉反应率较低。评价了该检测体系的稳定性，检测回收率在74-103%之间，批内变异系数5.0-19.0%，批间变异系数6.5-15.5%。 本研究确认了以生物法对金刚烷胺进行残留检测的可行性，建立了一种制备金刚烷胺生物识别材料的方法以及对金刚烷胺残留进行检测的生物学方法，为生物识别材料的制备、检测体系的性能评估、快速检测试剂盒的商业化开发等提供有效的数据参考。 收起