摘要: G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors,GPCR)作为最大的人膜蛋白受体家族，在细胞存活、维持细胞平衡、免疫监测、分子转运及神经调节等方面具有重要作用。因此目前全球市场70%以上的治疗药物都是针对GPCR,因此日益成为生物医药研究的重点、热点... 展开 G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors,GPCR)作为最大的人膜蛋白受体家族，在细胞存活、维持细胞平衡、免疫监测、分子转运及神经调节等方面具有重要作用。因此目前全球市场70%以上的治疗药物都是针对GPCR,因此日益成为生物医药研究的重点、热点和难点。但是GPCR高度疏水的7次跨膜结构，灵活的构象仍然给体外研究其功能活性造成了巨大的困难，因此构建一种筛选GPCR功能活性的平台无疑对药物高通量筛选具有重要意义。 目前新药筛选方法主要是在药物与某一种细胞GPCR相互作用后，借助荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)等生物物理方法，检测细胞内分子间相互作用激发的化学荧光信号，从而发现具有特定疗效的药物。虽然这种在细胞水平的方法稳定、适于自动化，但是仍然存在无效信号或信号偏差导致筛选过程复杂化，成本高、集成度小、筛选效率低。 因为病毒包膜上有许多规则排列的糖蛋白，如HSV-1的主要包膜糖蛋白gB(glycoprotein B,gB)、gC(glycoprotein C,gC),所以本研究中提出采用HSV-1病毒为载体，将具有代表性的人膜蛋白CD4（单次跨膜蛋白的模式蛋白）、GPCR77（多次跨膜蛋白的模式蛋白）像gB、gC那样整合在球形的HSV-1包膜上，然后把病毒加载到芯片上。这种芯片将锚定各种GPCR，有望在一次芯片反应中筛选出具有活性的GPCR，为药物的高通量筛选搭建新的平台。本论文研究主要内容及结果如下： [1]制备gB:CD4、gB:GPCR77、gC:CD4、gC:GPCR77四种HSV-1重组病毒 因为HSV-1是双链DNA，本文通过两种基因重组方法对HSV-1基因组编辑，表达外源天然膜蛋白或融合蛋白,通过病毒在细胞内的组装，制备gB:CD4、gB:GPCR77、gC:CD4、gC:GPCR77四种HSV-1重组病毒。gB:CD4、gB:GPCR77上的人膜蛋白CD4、GPCR77由HSV-1gB基因启动子表达，gC:CD4、gC:GPCR77上的CD4、GPCR77是CD4-gC和GPCR-gC的融合基因,由HSV-1gC基因启动子表达。该融合基因由CD4基因（去掉CD4跨膜区）、GPCR77基因（去掉最后一个跨膜区）分别与gC基因跨膜区和C-末端序列（32个氨基酸基因序列）融合而成。 i.采用HSV-1病毒系统。在A.1.1细胞内，将克隆在PK△4B△gBss质粒上的CD4基因、GPCR77基因（包括基因全长编码序列、末端加进的14个氨基酸V5 epitope tag序列及终止密码子TAG）分别重组到序列部分缺失的HSV-1基因组中gB基因的启动子下，制备人膜蛋白HSV-1重组病毒gB:CD4、gB:GPCR77。试验结果： a.通过免疫荧光试验(immunofluorescence assay,IFA)，应用CD4、GPCR77荧光抗体对gB:CD4、gB:GPCR77感染的细胞表面染色，发现具有很好的荧光信号。gD荧光抗体在所有感染细胞表面都有荧光信号(阳性对照)，但是野生型HSV-1(KOS)感染的细胞表面（负对照①）和没有病毒感染的细胞表面（负对照②）都没有检测到荧光信号。V5荧光抗体对感染细胞内染色，发现都呈现了强的荧光信号，说明CD4、GPCR77在细胞内获得了正确表达,并且在内质网、高尔基体、细胞表面有翻译后修饰的动态处理过程。 b.通过细胞免疫印迹试验(western blot,WB)和35S-methionine放射性活性标记的免疫沉淀试验(immunoprecipitation,IP)分析，在胶图gD条带大小相近，确保各种感染病毒数量一致的条件下，gB:CD4、gB:GPCR77感染的HFT细胞出现了清晰的CD4、GPCR77条带,而KOS病毒（HSV-1野生型，负对照①）和K082病毒(HSV-1gB基因缺失,负对照②）感染的HFT细胞则没有相应分子量条带的出现，与IFA试验结果相吻合。 c.通过流式细胞仪(flow cytometry,FCM)，PE-conjugated的荧光抗体在HSV-1病毒表面成功检测到了CD4、GPCR77的荧光信号。 结论：CD4、GPCR77分别整合到了gB:CD4、gB:GPCR77包膜，且在膜上整合的方向是正确的。 ii.采用RED/ETEcoli的细菌重组系统。通过两步将CD4-gC、GPCR77-gC融合基因同源重组进HSV-1基因组中，制备gC:CD4、gC:GPCR77重组病毒。 结论：WB、IP、FCM生化试验证明，这种通过基因融合的方法把融合蛋白CD4-gC、GPCR77-gC也整合到了HSV-1包膜，并且荧光信号比gB:CD4、gB:GPCR77更强。 [2]构建病毒芯片 取4种不同芯片表面，设计不同病毒浓度梯度（2倍稀释）和对照组，然后将野生型HSV-1加载在芯片上，发现FAST玻片具有最好的检测水平。由于gD荧光抗体信号强弱对病毒浓度梯度具有依赖性，可以确定最佳的芯片病毒加载量为800,000个/spot。试验结果:通过Cy5标记的anti-CD4、anti-GPCR77抗体检测芯片上的信号检测，发现gB:CD4、gB:GPCR77、gC:CD4、gC:GPCR77四种重组病毒荧光信号显著，但是KOS（HSV-1野生型，负对照①）和K082(HSV-1gB基因缺失型,负对照②）则没有信号，再一次证明CD4、GPCR77整合到了相应的重组病毒上，但在芯片上发现Cy5-标记的C5a配体仅能够特异的识别gC:GPCR77，却很难识别gB:GPCR77。 结论：CD4、GPCR77分别整合到了HSV-1包膜，但是GPCR77只在gC:GPCR77上保持完好的构象和活性，这为构建完整的GPCRs药物筛选芯片奠定了坚实的基础。 病毒芯片的成功构建将对生物医药领域产生重大影响，将为活性药物筛选、分子配体的鉴定、以及膜蛋白结构功能研究建立一个很好的平台。 收起