摘要: 本研究目的是用条斑紫菜6-磷酸海藻糖合成酶基因（PyTPS）转化水稻获得转基因植株，为筛选出耐盐、抗旱的转基因水稻植株与品系奠定基础，主要研究结果如下: 1、建立了水稻成熟胚愈伤组织为外植体的再生体系。 日本晴、台北309、中花11、旱稻29... 展开 本研究目的是用条斑紫菜6-磷酸海藻糖合成酶基因（PyTPS）转化水稻获得转基因植株，为筛选出耐盐、抗旱的转基因水稻植株与品系奠定基础，主要研究结果如下: 1、建立了水稻成熟胚愈伤组织为外植体的再生体系。 日本晴、台北309、中花11、旱稻297四个品种的种子在N6+2，4-D2mg/L+CH0.3g/L+脯氨酸2.878g/L培养基上可诱导出淡黄色颗粒状、结构致密的愈伤，愈伤在RGH6培养基上可分化出不定芽，分化率分别为78.8％，80.0％，70.6％和84.0％。在1/2MS+MET2mg/L培养基上可顺利生根，形成完整的植株。 2、建立了农杆菌介导的水稻遗传转化体系，获得了抗卡那霉素的再生植株。 在含卡那霉素、利福平与氯霉素三种抗生素的培养基上对农杆菌株AGL1(pCAMBIA2300-PyTPS)进行了严格的活化培养。利用针对目的基因的DNA引物（R1和3KpnI）、针对载体与目的基因的引物（35Sfor和P4）及针对NPTⅡ基因的引物（NPTⅡ-F和NPTⅡ-R）对PyTPS基因的植物表达载体进行了PCR鉴定，并分别扩增出了1300bp、500bp与600bp的特异性片段. 用100μmol/L乙酰丁香酮制备农杆菌悬浮液，成熟胚诱导的愈伤继代培养一周后，经过农杆菌悬浮液侵染20min，28℃黑暗中共培养3d，然后将愈伤组织接在筛选培养基上（N6+2，4-D2mg/L+麦芽糖20mmg/L+甘露醇36.43mg/L+Cef400mg/L+Km100mg/L+琼脂粉8.0g/LpH5.8），28℃暗培养20～25d后，进行第一次筛选。进行第二次筛选的培养基提高了卡那霉素浓度（N6+2，4-D2mg/L+麦芽糖20mmg/L+甘露醇36.43mg/L+Cef400mg/L+Km150mmg/L+琼脂粉8.0g/LpH5.8）。大部分愈伤组织在筛选10d左右开始褐化，然后在褐化组织的边缘选取重新长出乳白色愈伤抗性组织。 经2～3轮筛选后长出的抗性愈伤组织中挑选乳黄色致密性好的抗性愈伤组织转至28℃，16h/d光照条件下的分化培养基上，一般经过20d，有绿点出现，30～40d后进一步分化出小芽。当小芽长至约1cm时，移到生根培养基上，形成完整的植株。 3、建立了PCR扩增与鉴定体系，筛选出了水稻转基因植株。 用CTAB法提取水稻抗性植株与非转基因植株的DNA,并用作模板，用持家基因的引物PT1、PT2进行PCR扩增，均获得了350bp的目的条带，也就是说建立了水稻叶片DNA为模板的PCR扩增与鉴定体系。 以抗性植株的DNA为模板，用针对载体的引物（35Sfor）与针对目的基因PyTPS基因的引物(P4)进行PCR，扩增出了500bp的特异性片段，即获得了日本晴的转基因植株。 收起