摘要: 黄瓜是世界范围内的一种重要蔬菜。近年来,随着设施栽培面积的不断扩大,黄瓜越来越成为我国温室的主栽蔬菜作物之一。然而,由于温室的特殊环境如高温、高湿等,一些重要的病害严重地影响着黄瓜产品的产量和品质。其中,由于霜霉病菌生理小种的变异,先前... 展开 黄瓜是世界范围内的一种重要蔬菜。近年来,随着设施栽培面积的不断扩大,黄瓜越来越成为我国温室的主栽蔬菜作物之一。然而,由于温室的特殊环境如高温、高湿等,一些重要的病害严重地影响着黄瓜产品的产量和品质。其中,由于霜霉病菌生理小种的变异,先前鉴定的抗病基因dm-,dm-2和dm-3已经不能有效的防治该病害的发生,使得霜霉病(downy mildew)成为目前黄瓜生产上最重要的病害。因此,寻找新的抗性种质资源培育抗病品种是防治该病害发生的最经济、有效、安全的措施。 黄瓜/酸黄瓜抗霜霉病渐渗系(5211s)是在黄瓜属种间杂交(Cucumis hystrix×C.sativus)的基础上,通过多代回交、自交选育获得。在中国、美国和荷兰等地进行苗期和田间接种鉴定,5211S均表现对霜霉病有较高的抗性。为了加速此抗性种质资源在黄瓜育种中的应用,本文初步分离了5211S中抗病相关基因,评价了它们在生物胁迫和非生物胁迫条件下的表达情况,并且进一步分析了这些抗病基因之间的进化关系,为黄瓜抗病育种奠定了基础。此外,为了精确分析这些抗病基因的表达情况,我们运用实时定量PCR(qRT-PCR)技术对黄瓜常用内参基因的表达稳定性进行了评价。 具体结果如下: 1、黄瓜常用内参基因qRT-PCR表达稳定性评价 以黄/酸黄瓜抗霜霉病渐渗系5211S为材料,通过qRT-PCR技术结合生物学软件(geNorm、NormFinder和BestKeeper)评价了十个常用的内参基因在黄瓜不同组织中以及生物胁迫和非生物胁迫条件下的表达稳定性；不同组织包括根、茎和叶,生物胁迫主要为霜霉菌胁迫处理,非生物胁迫包括干旱、高盐、低温、高温及其外源激素如ABA、SA、MeJA、H2O2处理条件。 结果表明:在所有的12个黄瓜样品中,内参基因EF1α和UBI—ep表达较稳定。在黄瓜不同组织中,除了内参基因EF1α和UBI-ep外,TUA也表现较强的表达稳定性。在不同激素处理条件下,内参基因UBI-ep和TUA表现较强的表达稳定性。然而,在非生物胁迫处理条件下,仅仅内参基因EF1α表现出比较强的稳定性。可以看出不同条件下,内参基因的表达稳定性也不同；EF1α、UBI-ep和TUA最适合的内参基因。因此,我们在分析目的基因表达状况时,要根据具体的实验条件选择具体的内参基因。 2、黄瓜/酸黄瓜渐渗系NBS-LRR类型抗病基因的鉴定、特征及其与霜霉病相关基因的表达分析 根据NBS—LRR类型抗病基因设计兼并引物,以黄瓜抗霜霉病渐渗系5211S基因组DNA为模板,通过PCR技术分离与霜霉病相关的抗病同源基因(也称为抗病基因同源序列)；运用qRT-PCR技术分析了这些抗病基因在5211S根、茎、叶及其在胁迫条件下的表达情况；并且进一步分析了它们之间的进化关系。 结果表明:共分离获得了28条NBS-LRR类型抗病基因同源序列,系统发育树分析表明这些抗病基因可以分为4类,分别属于TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR两大类抗病基因。进化分析表明,除少数几个抗病基因经历“多样化选择”外,“纯化选择”在这些抗病基因进化过程中起着重要的作用。qRT-PCR分析表明他们在5211S根茎叶中是差异表达的；并且外源野生酸黄瓜的渐渗诱发了部分抗病基因的表达；其中,抗病同源基因CsRGA23的表达量比回交亲本“北京截头”增加了4倍。进一步研究发现,CsRGA23的表达能被霜霉菌及一些信号分子如MeJA,SA,ABA,和H2O2显著地诱导。表明外源野生酸黄瓜DNA的渐渗诱发抗病基因同源序列CsRGA23表达量的提高可能涉及到5211S对霜霉病的抗性形成。 3、葫芦科作物NBS-LRR类型抗病基因的比较聚类及分子进化分析 为了探明葫芦科作物NBS-LRR类型抗病基因的进化模式,我们从GenBank数据库中搜索了78条抗病基因,进行了他们之间的系统发育关系分析,这将对葫芦科作物NBS-LRR类型抗病基因的起源提供了理论基础。 本文所用78条抗病基因主要来自于黄瓜(43条),甜瓜(14条),南瓜(14条)和西瓜(7条)。系统进化树明显地把他们分为两个不同的分支,即TIR(Toll蛋白和白介素受体)分支和CC(在N端含有一个螺旋结构域的序列)分支,并且进一步可以细分为四个亚分支(TIR1、TIR2、CC1和CC2)。我们发现在这四个亚分支中,只有TIR1分支表现为物种特异性扩张(黄瓜)；其他三个亚分支都是由两个或三个物种的序列组成,形成不均匀的分支；表明这些抗病基因在在葫芦科作物分化后,在黄瓜中进行了特异性扩张。进一步与拟南芥抗病基因序列比较分析发现,除了少数几条序列外,绝大多数的葫芦科作物抗病基因同源序列在系统进化上与拟南芥不同。此外,序列分析还表明基因重复、序列差异和基因缺失在葫芦科作物NBS-LRR类型抗病基因进化中具有重要的作用。 4、黄瓜/酸黄瓜渐渗系Pto型抗病基因的分离、进化及表达分析 本文通过PCR技术分离黄瓜/酸黄瓜渐渗系的Pto类型抗病同源基因,分析了这些同源基因之间的系统发育关系,比较研究了他们与番茄Pto(编码丝氨酸/苏氨酸蛋白,STK)抗病基因的结构特征,进一步分析了他们在黄瓜基因组中进化方式。 我们共获得了18条STKs序列,系统发育分析这些序列分为8类。其中,6类属于黄瓜Pto型抗性基因同源序列(Pto-RGAs)。氨基酸序列比对发现这些Pto—RGAs都具有番茄Pto抗病基因的典型特征；但也出现氨基酸的缺失和插入现象,如在第133、134位两个氨基酸的缺失,第160、161、162位氨基酸的插入。另外,这些Pto—RGAs抗病基因之间的同义突变与非同义突变的比值(Ka/Ks)均小于1,表明了“纯化选择”在黄瓜/酸黄瓜渐渗系Pto类型抗病基因进化过程中起到了重要的作用。 5、黄瓜/酸黄瓜渐渗系类甜蛋白基因的克隆及表达分析 运用Tail-PCR技术从黄瓜/酸黄瓜抗霜霉病渐渗系中分离类甜蛋白(病程相关蛋白PR5同源基因)基因,qRTPCR技术分析了它在根茎叶的表达情况；并且进一步评价它在生物胁迫和非生物胁迫条件下的表达情况。 结果表明,黄瓜/酸黄瓜抗霜霉病渐渗系类甜蛋白基因被命名为CsPR5,该基因长1504 bp,含有726 bp的开放阅读框,编码241个氨基酸残基。BLAST搜索结果表明,该序列与其他物种的PR5同源基因有较高的同源性。qRT-PCR分析发现它在根茎叶中是差异表达的；进一步研究表明霜霉菌和一些外源信号物质(SA,MeJA,ABA,和H2O2)能显著了诱导CsPR5基因的表达。因此,CsPR5基因可能参与了5211S对病原菌入侵的分子防御反应,并有助于抵御环境胁迫。 收起