摘要: 合浦珠母贝(Pincatadafucata)又称马氏珠母贝，主要分布于太平洋、大西洋和印度洋的低纬度海区，在我国主要分布于广东、广西和海南等沿海地区，是我国生产海水珍珠的主要贝类之一，其生产的珍珠具有极高的经济价值。本研究在合浦珠母贝cDNA文库构建和... 展开 合浦珠母贝(Pincatadafucata)又称马氏珠母贝，主要分布于太平洋、大西洋和印度洋的低纬度海区，在我国主要分布于广东、广西和海南等沿海地区，是我国生产海水珍珠的主要贝类之一，其生产的珍珠具有极高的经济价值。本研究在合浦珠母贝cDNA文库构建和测序的基础上，经过EST序列比对，获得2个合浦珠母贝C-型凝集素(C-typelectin)基因，分别命名为PoLEC1和PoLEC2，分析了PoLEC1和PoLEC2的序列特征和组织表达调控模式，对PoLEC1进行了原核重组表达及功能分析，证实了其具有凝集细菌的活性，同时，克隆了PoLEC1基因组，经分析和筛选，获得了30个SNP位点，分析其与露空胁迫抗性的相关性，证实了PoCL-S18和PoCL-S26位点与抗露空胁迫显著相关，为合浦珠母贝分子标记辅助育种奠定了基础。 1.PoLEC1的序列、表达和功能分析 PoLEC1全长998bp，5’-UTR为33bp，3’-UTR为101bp，开放阅读框为861bp，编码287个氨基酸，分子量为31.68kDa，理论等电点约5.83。预测的氨基酸序列中含有信号肽(Met1-Ser19)和糖识别结构域，糖识别结构域中存在6个保守的半胱氨酸和1个糖结合位点。同源性分析结果表明，PoLEC1与其它物种C-型凝集素的糖识别结构域序列同源性在16.9-27.3％之间，相似性在28.9-48.5％之间。进化分析结果表明，PoLEC1与栉孔扇贝聚为一支，与无脊椎动物亲缘较近。组织表达模式分析表明PoLEC1mRNA在肝胰腺，外套膜、性腺、闭壳肌、肠、鳃和血淋巴组织均有表达，在肝胰腺中的表达量最高。经溶藻弧菌刺激后，PoLEC1mRNA在肝胰腺中的表达分析结果表明，在刺激后2h表达显著下调，而在4h和24h表达显著上调。利用PoLEC1成熟肽序列构建原核表达载体，在大肠杆菌中进行重组表达，用HisBind树脂纯化得到PoLEC1重组蛋白，细菌凝集实验表明其对大肠杆菌和芽孢杆菌有明显的凝集作用。 2.PoLEC2的序列分析和组织表达分析 PoLEC2全长为1659bp，5’-UTR为39bp，3’-UTR为45bp，开放阅读框为1575bp，可编码525个氨基酸，分子量约58.03kDa，理论等电点为5.22。PoLEC2氨基酸含有信号肽序列(M1-A16)、一个MAM-2结构域和一个C-型凝集素的糖识别结构域。同源性分析结果表明，PoLEC2与其它物种C-型凝集素的糖识别结构域序列的同源性在26.5-33.6％之间，相似性在45.1-55.6％之间。进化分析结果表明，合浦珠母贝与贻贝在进化树同一个分支上。组织表达模式分析表明PoLEC2mRNA在肝胰腺、外套膜、性腺、闭壳肌、肠和鳃组织均有表达，且在肝胰腺中的表达量最高。经溶藻弧菌刺激后24h，PoLEC2mRNA在肝胰腺中的表达显著上调；刺激后8h在肠中的表达量显著上调。 3.PoLEC1基因组的SNP分析 在PoLEC1的cDNA序列中设计引物，进行基因组扩增，成功地获得了基因组序列，全长4943bp，包括4个外显子和3个内含子，3个内含子的剪切位点都符合典型的GT/AG法则。同时，通过对基因组DNA的PCR产物直接测序，获得30个SNP位点，其中13个是内含子SNP，17个是外显子SNP，有13个cSNP是错义SNP引起氨基酸的变化。这些SNP位点的主要等位基因的频率是0.55-1.00，次要的等位基因频率0.00-0.45，经基因型进行哈代-温伯格平衡检验，16个SNP处于连锁不平衡，进行等位基因频率卡方检验，发现2个SNP位点((PoCL-S18和PoCL-S26)有显著差异(P<0.05)，这可能对合浦珠母贝耐露空的生态特征有重要影响。 收起