摘要: 目的： 通过计算机辅助软件及相关数据库等生物信息学技术与手段预测重组创伤弧菌溶细胞素(recombinant Vibriovulnificushemolysin，rVvhA)中可能存在的致凋亡肽功能模序，并利用原核克隆技术构建这一功能模序融合基因的原核表达载体。分离纯化克... 展开 目的： 通过计算机辅助软件及相关数据库等生物信息学技术与手段预测重组创伤弧菌溶细胞素(recombinant Vibriovulnificushemolysin，rVvhA)中可能存在的致凋亡肽功能模序，并利用原核克隆技术构建这一功能模序融合基因的原核表达载体。分离纯化克隆的融合蛋白，并对其进行蛋白质复性。通过作用于细胞等方法鉴定复性得到的融合蛋白的功能活性，进一步完善对天然创伤弧菌溶细胞素(Vibriovulnificuscytolysin,VVC)结构功能的研究，开发出新型的致凋亡肽，并以此为基础为改造该毒素的新药开发提供科学依据。 方法： 一、功能模序的预测及其原核克隆 利用生物信息学技术与方法对天然创伤弧菌溶细胞素进行结构和功能的预测。利用BLAST、motifscan、SMART、motifgenome、expasy、SWISS-MODEL等生物数据库及anthepro等生物信息软件分别对该蛋白质的核酸序列和氨基酸序列进行motif预测及其二级、三级结构的比对分析，分析其中是否含有致凋亡肽模序。致凋亡肽融合基因的原核克隆：以含pET-28a+)-rVvhA中的rVvhA基因为模板，设计合适的引物进行PCR扩增出目的基因，将目的基因亚克隆入pET-28a(+)表达质粒中，再进一步转化入E.coliBL21(DE3)中，限制性内切酶双酶切及测序鉴定转化成功后的质粒其序列是否正确。 二、重组表达载体的诱导表达及融合蛋白的复性与纯化 将已成功构建好的菌种IPTG诱导其表达，应用三步洗涤法结合Ni2+亲和层析方法对得到的目的蛋白进行分离纯化，通利用稀释复性法与分步透析相结合的方法进行蛋白质复性，SDS-PAGE鉴定得到的蛋白是否正确。 三、蛋白质活性功能检测 分别利用CCK-8法、ELISA法及激光共聚焦显微镜观察等方法和仪器对得到的重组蛋白的生物学活性进行鉴定。 结果： 一、通过利用生物信息学技术预测到创伤弧菌溶细胞素中含有致凋亡肽模序，该模序与蓖麻毒素B链的氨基酸序列有较高的同源性，可能具有与蓖麻毒素类似的蛋白功能活性，尤其是与蓖麻毒素B链具有更相似的活性。利用这一点，将rVvhA上相应的氨基酸序列逆转换成对应的核酸序列，得到399bp核酸序列。 对该核酸序列进行原核克隆，设计引物，将其重组入pET-28a(+)表达载体中，得到原核表达系统pET-28a(+)-rRicinB。克隆得到的工程菌E.coliBL21(DE3)双酶切及测序鉴定结果均表明这一系统与预期设计相同，载体构建成功。 二、含pET-28a+)-rRicinB重组质粒的E.coliBL21(DE3)菌株经0.5mmol/LIPTG诱导表达后可在21kDa处得到特异性条带，SDS-PAGE结果与该融合蛋白的理论推算值基本相符。表达的蛋白质经三步洗涤与Ni2+-NTA柱亲和层析法纯化后，得到较为纯净的蛋白质溶液，该溶液再通过稀释复性与分步透析相结合的方法进行复性，透析完后的蛋白质溶液进行冷冻干燥，SDS-PAGE鉴定纯化效果良好。 三、体外作用融合蛋白质于Hela细胞，CCK-8法检测其细胞毒性，发现其具有致细胞凋亡或坏死的功能，50%细胞存活率的浓度为1.323μg/mL;FITC标记蛋白，标记好的蛋白作用Hela细胞，4h后于激光共聚焦显微镜下观察，发现其能结合到细胞膜上，且在作用时间较长后该蛋白会进入细胞的细胞质中；ELISA法检测出其具有蓖麻毒素的活性。将细胞置于2.646μg/mL浓度的蛋白溶液作用4h后通过AnnexinV-FITC/PI荧光双染进行细胞凋亡现象观察与检测，发现在该浓度下细胞出现了凋亡或坏死现象。 结论： 本实验利用生物信息学技术与手段预测到了VVC中含有致凋亡肽模序，并成功地对这段模序的核酸序列进行原核克隆，构建得到pET-28a(+)-rRicinB表达系统，分离纯化且成功复性得到具有生物学活性的融合蛋白rRicinB。经过一系列生物学活性功能鉴定，发现该融合蛋白不仅具有蓖麻毒素的活性，还有细胞毒性作用，能引起Hela细胞的凋亡或坏死。同时，FITC标记蛋白发现其还具有与细胞膜结合的能力，为研发抗肿瘤药物提供了一些科学依据。 收起