摘要: 蓖麻毒蛋白是一种核糖体失活蛋白(ribosome-inactivating protein，RIPs)，由A、B两条链组成，其中A链为效应链。本试验以蓖麻毒蛋白A链基因为模板，设计并构建含有RTA基因的RNAi双元表达载体，以期在体内转录出含有RTA基因发夹结构的dsRNA，发挥干扰... 展开 蓖麻毒蛋白是一种核糖体失活蛋白(ribosome-inactivating protein，RIPs)，由A、B两条链组成，其中A链为效应链。本试验以蓖麻毒蛋白A链基因为模板，设计并构建含有RTA基因的RNAi双元表达载体，以期在体内转录出含有RTA基因发夹结构的dsRNA，发挥干扰RTA蛋白表达的作用，使蓖麻的脱毒提高到分子水平。 1.根据GenBank中发布的RTA基因序列设计了两对引物，引物两端分别插入不同的酶切位点。通过降落PCR扩增出两条长度为785bp的相同片段不同方向的蓖麻毒蛋白A链基因，将其分别命名为RTA-S和RTA-AS,将RTA-S和RTA-AS进行TA克隆，并将通过PCR鉴定和双酶切鉴定的克隆分别命名为pMD-RTA-S和pMD-RTA-AS。对pMD-RTA-S和pMD-RTA-AS芋列测定后与GenBank中RTA基因核苷酸芋列进行同源性分析，结果表明扩增出的RTA基因与已知RTA序列同源性分别为97.95％和97.96％。 2.双酶切pMD-RTA-AS与中间载体pHANNIBAL后将RTA-AS因片段与中间载体pHANNIBAL大片段连接，菌落PCR鉴定和双酶切鉴定，将鉴定正确的克隆命名为pHAN-RTA-AS。双酶切pHAN-RTA-AS与pMD-RTA-S回收并连接相应片段，将菌落PCR鉴定双酶切鉴定正确的克隆命名为pHAN-RTA-AS-S。双酶切pBI-121和pHAN-RTA-AS-S.回收相应片段、连接构建RNAi双元表达载体，将双酶切鉴定和PCR鉴定正确的重组质粒命名为pBI-RTA-AS-S即为RTA基因的RNAi双元表达载体。 3.将构建的RNAi双元表达载体pBI-RTA-AS-S功导入农杆菌LBA4404中。 收起