摘要: 霍乱是由霍乱弧菌引起的一种烈性肠道传染病，是世界七大流行病之一，为我国甲类法定传染病，具有发病急、传播快、波及面广等特点，危害极其严重。自1817年发现霍乱以来，已发生过7次世界性的大流行，因此其预防和控制受到各国政府的高度重视。预防霍... 展开 霍乱是由霍乱弧菌引起的一种烈性肠道传染病，是世界七大流行病之一，为我国甲类法定传染病，具有发病急、传播快、波及面广等特点，危害极其严重。自1817年发现霍乱以来，已发生过7次世界性的大流行，因此其预防和控制受到各国政府的高度重视。预防霍乱发生的有效方式除了有赖于安全水源和提高卫生条件外，更为重要的是发展廉价实用的霍乱疫苗。现有疫苗费用昂贵，贮存、运输相当困难，因此，研制成本低、使用简单、易于贮存运输的新疫苗是疫苗研究的一大热点。 植物基因工程技术的不断成熟为新型疫苗的研究提供了新的思路。转基因植物产生的疫苗，可由人体简单摄食含该种疫苗的植物组织，通过刺激机体黏膜的特异性免疫应答，使人体获得较持久的疾病防御能力。由于成本低廉、无需冷藏、无需一次性针头、使用方便，因此，“植物口服疫苗”得到了世界卫生组织(WHO)的提倡，开展这方面的研究对推动全球免疫计划的实施具有重要的意义。 本研究利用植物DNA重组技术，以胡萝卜下胚轴为受体材料，采用农杆菌介导法将霍乱毒素B亚单位基因(CTB)导入到胡萝卜中，得到了转CTB基因的T0代植株110棵，通过穴盘播种T1代种子得到T1代植株172棵。分别用通用引物和特异引物，对获得的卡那霉素抗性植株进行了PCR检测筛选。110株T0代植株中引物n1/n2检测出90株为阳性，阳性率达到81.8％，p1/p2和c1/c2检测阳性率分别为72.7％和34.5％；相应的T1代植株n1/n2、p1/p2、c1/c2检出阳性率最高分别为88.6％，74.3％，31.4％，遗传稳定性较好。 采用ELISA法对转基因植株中CTB表达水平进行了检测，结果表明导入的CTB基因在转基因胡萝卜中的整体表达水平不高，活性CTB含量最高为2.959 μg/g·FW，但在部分转基因植株中不表达；在转基因植株中，CTB表达存在器官特异性，在叶片和块根中均有特异性的表达，且叶片表达量较块根高，而在茎中却不表达。 进一步采用Western杂交对ELISA检测过的转基因胡萝卜的基因表达水平进行了分析，验证了转霍乱毒素B基因胡萝卜体内表达的CTB蛋白的存在，结果证实转基因胡萝卜中CTB可与抗体特异性结合，且复性后目的蛋白以五聚体的形式表达，这为进一步的动物试验研究打下了基础。 收起