摘要: 目的： 1、研究玻片覆盖组织块法原代培养人牙周膜成纤维细胞的成功率及生物学性状；在此基础上研究中药盐酸小檗碱、大黄素、六味地黄丸、人参皂甙Rg-1以及转化生长因子-B1、盐酸米诺环素对原代培养的人牙周膜细胞生物学活性的影响。 2、通过给... 展开 目的： 1、研究玻片覆盖组织块法原代培养人牙周膜成纤维细胞的成功率及生物学性状；在此基础上研究中药盐酸小檗碱、大黄素、六味地黄丸、人参皂甙Rg-1以及转化生长因子-B1、盐酸米诺环素对原代培养的人牙周膜细胞生物学活性的影响。 2、通过给Wistar大鼠肌注糖皮质激素及牙间结扎正畸钢丝建立一种近似人类临床牙周炎的动物模型。 3、分别研究六种中西药盐酸小檗碱、大黄素、六味地黄丸(大剂量组，小剂量组)、人参皂甙Rg-l以及转化生长因子-B。、盐酸米诺环素、人参皂甙Rg-1对大鼠实验性牙周炎模型的牙周组织中IL-1β、TNF-a、IL-6及BGP四种细胞因子表达的影响. 方法: 1、利用形态学、免疫组化方法、生长曲线测定来观察玻片覆盖法原代培养人牙周膜成纤维细胞的成功率及其生物学特性，并鉴定其来源； 2、在体外培养人牙周膜成纤维细胞的基础上，采用噻唑蓝(MTT)比色法、考马斯亮蓝法、酶动力学方法探讨盐酸小檗碱、大黄素、六味地黄丸、人参皂甙以及转化生长因子-β1、盐酸米诺环素对原代培养的人牙周膜细胞增殖活性、蛋白合成、碱性磷酸酶(ALP)活性的影响； 3、采用细胞培养和流式细胞技术，观察药物对离体人牙周膜成纤维细胞细胞周期的影响； 4、体外培养人牙周膜细胞经钙荧光指示剂Fluo-3负载后，用激光扫描共聚焦显微镜测定药物影响前后的人牙周膜细胞内钙随时间变化情况； 5、将大鼠随机分成正常组、对照组及实验组，对照组和实验组给予左上颌第二磨牙钢丝结扎和醋酸泼尼松龙肌肉注射； 6、在成功建立大鼠实验性牙周炎模型的基础上，实验动物分别灌服盐酸小檗碱、大黄素、六味地黄丸(小剂量组大剂量组)、人参皂甙Rg-1以及转化生长因子-β1。、盐酸米诺环素，于第1、2、3、4周分批处死(每次每组10只)，取牙周组织标本作切片，行常规HE染色，观察牙周组织病理变化状况，并采用免疫组织化学法检测IL-1β、TNF-αa、IL-6、BGP水平变化。 结果: 1.玻片覆盖法可显著提高人牙周膜细胞原代培养的成功率。 2对牙周膜细胞增殖的影响： 本实验所选六种药物均能明显增强人牙周膜细胞增殖能力，且盐酸小檗碱在10-20mg/L浓度范围内作用时间最长；大黄素在20-50μg/mL浓度范围内作用时间最长；六味地黄丸在10-50g/L，浓度范围内作用时间最长；人参皂甙Rg-1在0.005-0.01μmol/L浓度范围内作用时间最长；转化生长因子-β1在2-10μg/L浓度范围内作用时间最长；盐酸米诺环素在20-100mg/L浓度范围内作用时间最长。 3.对牙周膜细胞蛋白含量的影响： 4对牙周膜细胞ALP活性的影响： 5对牙周膜细胞内游离钙离子浓度的影响： 6对细胞周期的影响： 7大鼠实验性牙周炎动物模型的成功建立. 8药物对大鼠牙周组织中有关细胞因子表达的影响及效果对比：六种药物均可以提高大鼠牙周组织中BGP因子的表达水平，降低IL-6、IL-1β、TNF-a等因子的表达水平。 8.1大黄素治疗组： IL-1β从治疗第一周起与对照组比较有统计学意义(P＜0.05)，与正常组比较第二周开始趋于正常(P＞0.05)。IL-6从治疗第三周起与对照组比较有统计学意义(P<0.05)，与正常组比较第三周开始趋于正常(P>0.05)。TNF-α从治疗第三周起与对照组比较有统计学意义(P＜0.05)，与正常组比较第三周开始趋于正常(P>0.05).BGP从治疗第二周起与对照组比较有统计学意义(P＜0.05).与正常组比较第二周开始趋于正常(P＞0.05)。 8.2人参皂甙Rg-1治疗组： BGP与正常组比较第四周起趋于正常(P＞0.05)，与对照组比较第二周开始有意义(P＜0.05)。IL-1β与正常组比较第二周起趋于正常((P＞0.05)，与对照组比较第二周开始有意义((P＜0.05)。IL一6与正常组比较第二周起趋于正常((P＞0.05)，与对照组比较第二周开始有意义((P＜0.05)。TNF-α与正常组比较第三周起趋于正常((P＞0.05)，与对照组比较第二周开始有意义((P＞0.05)。 8.3大剂量六味地黄丸治疗组： BGP与正常组比较的三周起趋于正常((P＞0.05)，与对照组比较第二周开始有意义(P＜0.05)IL-1β与正常组比较第三周起趋于正常((P＞0.05)，与对照组比较第三周开始有意义((P＜0.05).IL-6与正常组比较第三周起趋于正常((P＞0.05)，与对照组比较第三周开始有意义((P＜0.05)。TNF-α与正常组比较第四周起趋于正常((P＞0.05)，与对照组比较第二周开始有意义((P＜0.05)。 8.4小剂量六味地黄丸治疗组： BGP与正常组比较第四周起趋于正常((P＞0.05)，与对照组比较第二周开始有意义(P<0.05).IL-1β与正常组比较第三周起趋于正常((P＞0.05)，与对照组比较第三周开始有意义(P<0.05)。IL-6与正常组比较第三周起趋于正常((P＞0.05)，与对照组比较第三周开始有意义(P<0.05)。TNF-α与正常组比较第三周起趋于正常((P＞0.05)，与对照组比较第三周开始有意义((P＞0.05). 8.5盐酸米诺环素治疗组： BGP与正常组比较第四周起趋于正常((P＞0.05)，与对照组比较第二周开始有意义(P＜0.05)。IL-1β与正常组比较第二周起趋于正常(P＞0.05)，与对照组比较第二周开始有意义(P<0.05)。IL-6与正常组比较第二周起趋于正常(P＜0.05)，与对照组比较第二周开始有意义(P<0.05)。TNF-α与正常组比较第三周起趋于正常(P＞0.05)，与对照组比较第三周开始有意义(P<0.05)。 8.6转化生长因子治疗组： BGP与正常组比较的四周起趋于正常(P＞0.05)，与对照组比较第一周开始有意义(P<0.05)。IL-1β与正常组比较的三周起趋于正常(P＞0.05)，与对照组比较第三周开始有意义(P<0.05)。IL-6与正常组比较第三周起趋于正常(P＞0.05)，与对照组比较第二周开始有意义(P<0.05)。TNF-a与正常组比较第四周起趋于正常(P＞0.05)，与对照组比较第三周开始有意义(P<0.05)。 8.7盐酸小檗碱治疗组： IL-1β与对照组比较从治疗第一周到第四周均具有统计学意义，TNF-α的结果也相同。 8.8中药与西药之间治疗效果的比较显示： 8.8.1 BGP因子表达结果显示：治疗第三周转化生长因子分别与大剂量六味地黄丸，人参皂甙Rg-l，米诺环素比较的结果显示差异有统计学意义；治疗第四周人皂甙Rg一1和转化生长因子-β1。比较差异有统计学意义。其余比较均无差异。 8.8.2 IL-6因子表达结果显示：治疗第一周米诺环素分别与小剂量六昧地黄丸，大黄素，转化生长因子-β1比较差异有统计学意义。治疗第二周小剂量六味地黄丸分别与转化生长因子-β1，米诺环素比较差异有统计学意义。其余比较均无差异。 8.8.3 IL-1β因子表达结果显示：治疗第二周盐酸小檗碱与米诺环素之间比较差异有统计学意义，转化生长因子-β1与人参皂甙Rg-1及盐酸小檗碱分别比较差异有统计学意义；治疗第三周大黄素分别与转化生长因子-β1，盐酸米诺环素相比较差异具有统计学意义；治疗第四周盐酸小檗碱分别与转化生长因子-β1及盐酸米诺环素相比较差异具有统计学意义。其余比较均无差异。 8.8.4 TNF-a因子表达结果显示：治疗第一周组盐酸小檗碱分别与转化生长因子，盐酸米诺环素相比较差异有统计学意义；人参皂甙Rg-1与转化生长因子-β1相比较差异有统计学意义；盐酸米诺环素与大剂量六味地黄丸，大黄素相比较差异有统计学意义；治疗第二周组盐酸小檗碱分别与转化生长因子-β1,盐酸米诺环素相比较差异具有统计学意义；转化生长因子-β1与人参皂甙Rg-1相比较差异具有统计学意义。其余比较均无差异。 结论: 玻片覆盖组织块法可显著提高人牙周膜细胞原代培养的成功率。盐酸小檗碱、大黄素、六味地黄丸、人参皂甙Rg-1以及转化生长因子-β1、盐酸米诺环素在一定浓度范围内能提高牙周膜细胞的增殖活性、蛋白合成及碱性磷酸酶活性。TGF-β1、人参皂甙Rg-1使牙周膜成纤维细胞G1期细胞减少，S期细胞增加，促进更多的细胞进入增殖状态，且TGF-β1、人参皂甙Rg-1、大黄素可能通过改变细胞内游离钙离子的浓度，达到其促进细胞增殖的作用。牙间结扎加糖皮质激素注射的方法可成功地建立近似于人类临床牙周炎的动物模型，为下一步研究中西医结合防治牙周炎提供了很好的实验基础。以上六种药物均对细胞因子的表达有一定的影响且具有统计学意义，并且药物之间比较作用差异较小，证明上述药物均对大鼠牙周炎症有一定的治疗作用，可以促进组织的愈合。且由于中医药的综合、绿色、天然、保健、环保与西药降低人体免疫力形成鲜明对比，毒副作用很少，用药相对安全，服务方式灵活，费用比较低廉，因此具有巨大的创新潜力和广阔的发展空间。根据上述结果证实盐酸小檗碱、大黄素、六味地黄丸、人参皂甙Rg-1以及转化生长因子-β1、盐酸米诺环素可促进创伤愈合和组织再生，从而为牙周病临床的合理用药提供科学依据。 收起