摘要: 本文将在此理论基础上通过反复转移的非黏附细胞培养法分离小鼠骨髓中的非黏附间充质干细胞；观察表皮生长因子对非黏附间充质干细胞克隆形成效率的调节作用；并深入探讨非黏附骨髓间充质干细胞在体外、体内尤其是缺血损伤的微环境中分化为神经细胞的... 展开 本文将在此理论基础上通过反复转移的非黏附细胞培养法分离小鼠骨髓中的非黏附间充质干细胞；观察表皮生长因子对非黏附间充质干细胞克隆形成效率的调节作用；并深入探讨非黏附骨髓间充质干细胞在体外、体内尤其是缺血损伤的微环境中分化为神经细胞的潜能，为这些细胞进一步用于细胞移植治疗相关疾病提供技术参数。 第一部分:小鼠非黏附骨髓间充质干细胞的分离培养、鉴定以及表皮生长因子对其克隆形成效率的影响 目的：分离培养并鉴定小鼠骨髓中的非黏附间充质干细胞( Non-adhaerent Bone-Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells，NA-BM-MSC)；观察表皮生长因子(Epidermal Growth Factor，EGF)对NA-BM-MSC产生成纤维细胞集落形成单位(colony-formingunits-fibroblast，CFU-F)效率的影响。 方法：分离小鼠总骨髓细胞，分两组体外培养，一组在总骨髓细胞中加入10ng/mL的EGF，另一组为对照组，每天转移未贴壁的非黏附骨髓细胞(Non-adherent Bone Marrow Cells,NA-BMC)到新的培养皿中继续培养，每组中各皿细胞长满12天后，亚甲基蓝染色显示形成的克隆，计数克隆个数；在总骨髓细胞培养到第四天时收集未贴壁的NA-BMC到新的培养血中，待细胞贴壁生长达融合后传代纯化，取第四代细胞接种于向脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞诱导分化的培养液中，2周后分别进行油红染色、抗Ⅱ型胶原的免疫组织化学染色以及茜素红染色检测脂肪滴、Ⅱ型胶原和钙化结节的形成和表达情况；流式细胞检测表面标记物的表达。 结论：小鼠骨髓细胞培养过程中，24小时内未贴壁的NA-BMC转移到新培养皿中继续培养能够重新贴壁并形成CFU-F，并且NA-BMC所形成的克隆具有向脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞分化的能力，具备了干细胞自我复制更新和多分化潜能的两大特性，并表达间充质细胞的特异性标记物，因此称其为非黏附骨髓间充质干细胞(NA-BM-MSC)。EGF能有效促进NA-BM-MSC的增殖，进一步提高了该细胞的富集效率。 第二部分:非黏附骨髓间充质干细胞体外向神经细胞分化的实验研究 目的：探讨骨髓中存在的NA-BM-MSC在体外向神经细胞分化的能力。 方法：分离小鼠骨髓总细胞进行培养，于第四天收集未贴壁的NA-BMC到新的培养环境中继续培养，待细胞贴壁融合后传代纯化，取第四代细胞用于诱导实验；细胞按照1X103/Cm2的密度接种于预置盖玻片的六孔板中，细胞贴壁后，更换培养液为含20ng/ml的EGF和20ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子-2(b-FGF)的诱导液进行诱导，2周后，甲苯胺蓝染色和抗神经细胞特异性核蛋白、抗神经中间丝蛋白的免疫细胞化学染色检测神经细胞特异性蛋白的表达。 结论：NA-BM-MSC在适当的条件下能够被诱导分化成神经细胞，为下一步用于体内实验的研究提供了保证。 第三部分:非黏附骨髓间充质干细胞在缺血损伤脑内向神经细胞分化的实验研究 目的：探讨骨髓非黏附间充质干细胞(non-adherent bone marrow mesenchymal stem cells，NA-BM-MSC)在缺血损伤的脑内存活以及向神经细胞分化的能力。 方法：从β-Gal转基因小鼠分离总骨髓细胞，培养到第四天时，收集未贴壁的NA-BMC到新的培养环境中继续培养，贴壁增殖，待生长到融合时传代纯化，取第4代NA-BM-MSC定向移植到小鼠大脑中动脉阻塞脑缺血模型脑内，8周后LacZ组织化学染色和免疫组织化学染色法观察供体细胞在缺血脑内微环境中的存活情况以及神经元特异性核蛋白(NeuN)、神经胶质细胞特异性酸性蛋白(GFAP)的表达。 结论：小鼠骨髓内的NA-BM-MSC在缺血损伤的脑内能够存活、迁移，部分细胞还能分化为成熟的神经元或神经胶质细胞参与脑损伤的修复，为下一步作为种子细胞用于移植修复实验提供了保证。 本课题的特征和创新之处在于： 通过反复转移的非黏附细胞培养法成功分离出非黏附的骨髓细胞，并通过克隆的形成、向间质细胞的诱导分化以及表面标记物的检测证实了这些细胞具有的干细胞特征，为临床上从有限的骨髓样本中获得更多的骨髓间充质干细胞提供了保证；EGF能有效促进非黏附骨髓间充质干细胞在体外的扩增，进一步提高了干细胞移植种子细胞的富集效率。本研究还证实了非黏附骨髓间充质干细胞具有在体外向神经细胞分化的能力，并将其移植到缺血损伤的脑内进一步证实了其向神经细胞分化的能力，为干细胞移植修复脑损伤提供了理论基础。 收起