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国家工程技术图书馆
2022年11月29日
摘要: 研究背景: 脂联素(Adp)作为一种脂肪源性的细胞因子,具有改善胰岛素敏感性、保护内皮细胞功能、抗炎、抗动脉粥样硬化的作用。流行病学研究显示脂联素水平与胰岛素抵抗及血栓性疾病发病呈负相关。脂联素可以抑制单核细胞黏附分子及炎症因子的表达... 展开 研究背景: 脂联素(Adp)作为一种脂肪源性的细胞因子,具有改善胰岛素敏感性、保护内皮细胞功能、抗炎、抗动脉粥样硬化的作用。流行病学研究显示脂联素水平与胰岛素抵抗及血栓性疾病发病呈负相关。脂联素可以抑制单核细胞黏附分子及炎症因子的表达、抑制巨噬细胞转化为泡沫细胞、抑制血管平滑肌细胞增殖及迁移,还可以增加内皮细胞一氧化氮产生及减少氧自由基的产生。脂联素可通过胰岛素增敏、抗炎、抗动脉粥样硬化、抗增殖和抗氧化等多重机制来保护内皮细胞功能。 由于血栓性疾病与凝血系统活性密切相关,而内皮细胞功能障碍可以引起凝血活性异常。但是对于脂联素对凝血系统活性有无影响,目前仍不清楚。组织因子(TF)是凝血系统启动的关键因子,TF介导的凝血激活在动脉粥样硬化、冠心病等血栓形成性疾病的发病中起了非常重要的作用。组织因子途径抑制物(TFPI)是TF直接的生理性抑制物,在调节血栓形成过程中有重要作用。然而,脂联素对内皮细胞的保护作用是否会影响在血栓形成过程中有重要作用的凝血因子TF及TFPI的表达,国内外尚无文献报道。因此研究脂联素对凝血活性的影响有着重要的意义,可以进一步阐明血栓形成的部分机制,并能为防治血栓形成提供重要的理论依据。正是基于上述原因,本研究对脂联素对内皮细胞TF及TFPI表达的影响及机制进行探讨。 本研究由以下三部分组成: 第一章 TNF-α对内皮细胞组织因子和组织因子途径抑制物表达的影响 目的:观察在肿瘤坏死因子-α(TNF-α)刺激下对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)表达TF及TFPI的影响。 方法:HUVECs培养采用RPMI 1640完全培养基;台盼蓝染色法观察细胞活力;酶联免疫吸附分析(ELISA)法测定TF抗原和TFPI抗原的表达;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测TF及TFPI基因的表达。 结果:各浓度的TNF-α对HUVECs的细胞活力无明显影响;TNF-α促进TF抗原的表达,并呈剂量和时间依赖关系,在TNF-α10 ng/ml作用6h时最明显;TNF-α促进TF mRNA的表达,并呈剂量和时间依赖关系,在TNF-α10ng/ml作用3h时已非常明显,6h时达到高峰;TNF-α对HUVECs表达TFPI抗原及TFPI mRNA无明显影响。 结论:TNF-α可以诱导HUVECs细胞表达TF;TNF-α对HUVNEC细胞TFPI的表达无明显影响。 第二章脂联素对TNF-α诱导内皮细胞组织因子和组织因子途径抑制物表达的影响 目的:观察脂联素对TNF-α诱导HUVECs细胞表达TF和TFPI的影响。 方法:HUVECs培养采用RPMI1640完全培养基;台盼蓝染色法观察细胞活力;ELISA法测定TF抗原和TFPI抗原的表达;发色底物法测定TF及TFPI活性; RT-PCR检测TF mRNA及TFPImRNA的表达。 结果:各浓度的脂联素对HUVECs的细胞活力无明显影响;脂联素可以在转录水平、蛋白水平上抑制由TNF-α诱导的人脐静脉血管内皮细胞TF的表达,同时TF活性水平也明显减低;单纯脂联素对内皮细胞表达TF表达无影响;脂联素可以上调TFPI的抗原水平及活性水平,但脂联素不影响TFPI mRNA的表达水平。 结论:脂联素可以在转录及蛋白水平上明显抑制TNF-α诱导HUVECs细胞TF的表达;脂联素上调TFPI抗原表达可能是在转录后水平进行的。 第三章脂联素调节内皮细胞组织因子和组织因子途径抑制物表达的机制研究 目的:前文已经报道脂联素能抑制TNF-α诱导的HUVECs表达TF,并能在转录后水平上调TFPI的表达。本实验详细探讨脂联素抑制TNF-α诱导的HUVECs表达TF及上调TFPI表达的信号传导通路。 方法:HUVECs培养采用RPMI 1640完全培养基;台盼蓝染色法观察细胞活力;ELISA法测定TF抗原和TFPI抗原的表达;发色底物法测定TF及TFPI活性;ELISA法检测NF-κB结合活性;酶免疫分析(EIA)法检测cAMP含量;PepTag法分析PKA活性水平;蛋白印迹法检测p38MAPK、p44/42MAPK、SAPK/JNK、Akt、IκB-α的蛋白磷酸化水平。 结果:脂联素使IκB-α磷酸化水平减少,但对p38MAPK、p44/42MAPK及SAPK/JNK的磷酸化水平无影响;脂联素呈剂量依赖性的增加cAMP含量和PKA活性水平;脂联素抑制TNF-α诱导的TF表达可以被PKA的特异性抑制剂Rp-cAMPs逆转,并不影响脂联素上调TFPI抗原的水平;脂联素使Akt的磷酸化水平增加;脂联素可明显抑制TNF-a诱导的IkB-a的磷酸化水平及NF-kB结合活性水平;PI3K的特异性抑制剂LY294002也能部分逆转脂联素对TF表达的抑制作用,预先联合Rp-cAMPs和LY294002处理细胞能使脂联素的抑制作用被逆转约95%,脂联素对TFPI抗原的上调作用不被这两种抑制剂影响。 结论:PI3K-Akt和cAMP-PKA信号途径的活化介导了脂联素抑制TNF-a诱导内皮细胞表达TF的作用;NF-kB信号途径活性受抑在脂联素抑制TNF-a诱导的内皮细胞表达TF起了非常重要的作用;PI3K-Akt和cAMP-PKA是NF-kB上游重要的信号通路。 收起
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