摘要: 本研究根据GenBank中已有的水稻条纹病毒(Rice stripe virus，RSV)基因序列，设计了RSV编码的7个基因的特异性引物，应用实时荧光定量PCR方法(Real-time PCR )，建立了RSV的Real-time PCR的检测体系。对RSV侵染后不同时间点的水稻悬浮细胞和不同传毒效... 展开 本研究根据GenBank中已有的水稻条纹病毒(Rice stripe virus，RSV)基因序列，设计了RSV编码的7个基因的特异性引物，应用实时荧光定量PCR方法(Real-time PCR )，建立了RSV的Real-time PCR的检测体系。对RSV侵染后不同时间点的水稻悬浮细胞和不同传毒效率的灰飞虱进行了检测，得到了RSV 7个基因的mRNA表达情况。 以水稻的模式种--日本睛为材料，建立了水稻悬浮细胞系，通过PEG介导的方式将RSV接种到水稻悬浮细胞内。不同时间点取样，提取总RNA，以其为模板合成RSV编码的7个基因和内参基因的第一链cDNA。应用SYBR Green I荧光染料法进行Real-time PCR，检测RSV各个基因在不同时间点取样样品中的mRNA相对表达量。结果表明：在RSV侵染水稻悬浮细胞后0 h、12 h、24 h、36 h、48 h和60 h均能检测到RSV 7个基因的存在。其中RdRp基因的mRNA表达量在RSV侵染水稻悬浮细胞后12 h达到高峰，其表达量为侵染初期的45.07倍，与其它6个基因的mRNA表达量的变化显著不同。其它6个基因(NS2、NSvc2、NS3、CP、SP和NSvc4)的mRNA表达量均在RSV侵染后48 h达到表达高峰，其mRNA表达量分别是侵染初期的21.08、10.92、11.99、140.14、50.19和1.54倍。上述表明RSV侵染水稻悬浮细胞后48 h达到复制高峰。采用t-test对RSV 7个基因在水稻悬浮细胞内病毒侵染复制过程中的mRNA表达量变化的差异显著性进行分析，结果显示RdRp基因mRNA表达量的变化最显著，其t值为2.67(P=0.05～0.025)。CP基因的mRNA表达量变化最稳定，其t值为1.35(P=0.40～0.20)。 经过4代的杂交选育，选育了3种不同的灰飞虱群体：高效传毒(HETP)、低效传毒(LETP)和带毒不传毒灰飞虱群体(NTVP)。高效传毒群体内的单头灰飞虱的传毒率为95％，低效传毒群体内的单头灰飞虱的传毒率仅为5％，带毒不传毒群体内的单头灰飞虱的传毒率为0。说明带毒不传毒的灰飞虱可以通过饲毒获得RSV病毒，但是却不能将病毒传给健康的水稻植株。这些结果进一步证实了灰飞虱的传毒能力是可以通过连续的人工杂交选育而改变的。应用Real-time PCR对RSV 7个基因在这3种灰飞虱群体内的mRNA表达进行了检测。结果显示：RSV 7个基因在高效传毒和低效传毒灰飞虱体内的表达量均大于其在带毒不传毒灰飞虱体体内的表达量，但是除NSvc2和NSvc4外其余5个基因在高效传毒灰飞虱体内的表达量均小于其在低效传毒灰飞虱体内的表达量。表明NSvc2和NSvc4与昆虫介体灰飞虱的传毒能力成正相关。CP基因在高效传毒和低效传毒灰飞虱体内的表达量明显高于其在带毒不传毒灰飞虱体内的表达量。NS3基因在三种不同传毒效率灰飞虱体内的表达量没有明显的变化，一直处于一个稳定的状态。 收起